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Lipocalin型前列腺素D合成酶（Lipocalin-type Prostagladin D Synthase,L-PGDS）亦称β-trace protein，是机体组织屏障的主要成分，属Lipocalin家族。Lipocalins为一组分子量较小的分泌性蛋白质，它们的共同特性是可结合和运输亲脂／疏水分子，L-PGDS为此家族中惟一有酶活性者。L-PGDS主要分布于哺乳动物的中枢神经系统和雄性生殖器官，并分泌至脑脊液、血清、精液、尿液、羊水等体液中。L-PGDS是一种双功能蛋白，除催化PGD2产生外，亦可结合和运输亲脂／疏水分子。该蛋白具有广泛的生理学作用，它不仅与睡眠诱导、体温调节、感受伤害、气味应答有关，亦是一种生育相关蛋白，可能参与精子的发生和成熟。研究显示，对于一些神经系统疾病、肾脏疾病、心血管疾病、生殖系统疾病等，L-PGDS已成为一个有用的诊断指标。为了建立L-PGDS的免疫学检测方法并探讨其在男性生殖系统中的具体功能、代谢过程、作用机制以及与男性不育的关系等，就必须得到大量的纯化L-PGDS抗原和相应的抗体。 本研究第一部分首先用PCR的方法从质粒pGEX-2T／htL-PGDS上扩增出人睾丸L-PGDS成熟肽基因编码序列，克隆至T载体。测序结果表明，PCR扩增的DNA片段与所报道的人睾丸L-PGDS cDNA完全一致。然后用EcoRⅠ、NotⅠ分别对克隆有L-PGDS的质粒pGEM-T／htL-PGDS和酵母表达质粒pPIC9进行双酶切，T4连接酶将L-PCDS基因片段与线性化的pPIC9连接，构建了真核表达载体pPIC9／htL-PGDS。 在第二部分试验中，BglⅡ将重组质粒pPIC9／htL-PGDS线性化后，电穿孔法将其导入巴斯德毕赤氏酵母GS115。菌落PCR对酵母转化菌进行鉴定后，甲醇诱导重组蛋白的表达，结果得到一株L-PGDS表达阳性克隆，Mr约为27000，与理论值完全一致。培养上清经SDS-PAGE电泳后，进行薄层扫描分析， 南京医科大学硕士学位论文M为 27 000的 LPGDS的含量约占酵母培养上清中总蛋白含量的 18o。Bradford法测定培养上清的总蛋白含量约为 150mg／L，因此，重组 LPGDS的表达量可达27mg／L左右。 本文第三部分通过镍离子金属亲和层柱对重组卜阳m进行了纯化，并用糖旮酶 F对其进行了消化。结果表明，通过Plthlti Pastorlj系统表达的重组蛋白除 M为 27 000勺主带卜，尚存在 M为 24 000、ZI 000的两条弱带，这两条弱带为糖基化不完全所致。纯化蛋白与视黄酸结合后，其紫外吸收波谱发生红移，证实重组 LPGDS具有生物学活性。Western blotting分析亦表明重组 LPGDS可与兔抗人 LPGDS多克隆抗体发生特异结合。 第四部分采用杂交瘤技术，将骨髓瘤细胞SPZ川与分。必LIGDS抗体的小鼠脾细胞融合成杂交瘤细胞，利用瘤细胞无限增殖及免疫细胞分泌抗体的能力大量制备针对LPGDS抗原的MCAb。首先以重组LPGDS作为抗原免疫－BALB止小鼠；免疫成功后取小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2／0融合，通过阳性克隆有限稀释法；得到一株 Ig＊类 LIGDS McAb；再将生长良好的杂交瘤细胞接种到石蜡油预处理的 BALB七小鼠腹腔中，制备腹水型抗人LPGDSMCAb。酶联免＆吸附试验汪LISA)证明其滴度可达 1：5＼ l：5’；WesternElotting鉴定表明该 McAb能特异性地结合精浆中 M为 27 000的L－PGDS。