我国拥有庞大的畜禽肉消费群体,但目前国内外肉类掺假情况却令人堪忧,许多不良商家为使利益最大化,用廉价肉、劣质肉替代或是部分替代高价肉的手段来达到目的,这严重损害了消费者的利益,也对市场监管带来不利影响。而目前的检测方法主要是定性或半定量技术,对非法添加还是无意污染无法准确区分。本研究建立的方法主要运用了实时荧光定量PCR和微滴数字PCR检测技术,实时荧光定量PCR在反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。而数字PCR利用有限稀释法和根据泊松分布统计原理来计算DNA浓度,无需标准曲线,且不受不同样品和试验过程中PCR扩增效率变化的影响,就能实现低至单个拷贝核酸分子的绝对定量。而方法中加入的内标物种与样品同时进行前处理、提取和PCR扩增,能够有效减少客观因素对结果的影响。研究运用实时荧光定量PCR与微滴数字PCR检测技术建立了羊源性成分定量检测方法,主要研究结果如下:(1)研究选取了羊、牛源性成分的单拷贝基因进行引物探针的设计,通过对多个物种的基因组序列进行同源性比对,选取目标物种的特异性保守区域,分别设计了羊、牛源性的特异性通用引物探针,并对反应体系进行条件优化。设计的两对引物、探针都具有良好的特异性,均只与目标物种发生反应,未发生非特异性扩增,检测体系具有良好的扩增效果。(2)研究了不同的样品前处理方式对羊肉基因组DNA定量的影响,包括标准品制备方法的重复性及稳定性研究、动物基因组DNA不同提取方法的比较研究以及样品中添加不同种类与不同含量的基质肉对羊肉基因组DNA的提取和qPCR扩增的影响。研究结果表明,实验所用的标准样品制备方法重复性和稳定性较好,4种提取方法中磁珠法更适合用于动物基因组DNA的提取,不同种类的基质肉对羊肉基因组DNA的提取与扩增几乎无影响,实验结果无明显差异。(3)基于基因拷贝数构建了样品中羊肉含量与Ct值的数学模型,进一步建立了qPCR定量检测方法,最终能仅对样品DNA进行qPCR就直接计算样品中羊肉含量。实验结果表明:方法建立的函数关系都具有良好的线性,R~2均大于0.99。方法具有良好的重复性和稳定性,检测限为5%,具有较好的准确性。(4)建立了ddPCR内标定量方法,向样品中添加一定量内标后提取DNA,运用双重ddPCR分别测定目标和内标的基因拷贝数,构建检测目标与内标的拷贝数比值与样品质量的函数关系,结果表明:方法建立的函数具有良好线性关系,R~2均大于0.99,且方法稳定性、重复性和准确性都满足定量要求,定量检测限达5%,可应用于实际检测。(5)应用本论文建立的qPCR绝对定量方法和ddPCR内标定量方法,对成都海关技术中心提供的28份羊肉样品进行了定量检测,对两种定量方法的检测结果进行了分析。综上所述,本研究基于qPCR和ddPCR建立的羊源性成分定量检测方法,能够快速、有效地对样品中的羊源性成分进行定量检测,特异性强且结果准确,可为相关执法部门提供可靠依据。