【摘 要】
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植物螯合肽合成酶（phytochelatin synthase,PCS）是参与植物重金属解毒与积累的关键酶。PCS在植物体内以谷胱甘肽（glutathione,GSH）为底物合成植物螯合肽PCs（phytochelatins）,PCs螯合重金属后形成螯合物,缓解了重金属对植物的毒害,在植物解除重金属的毒性方面具有重要作用。课题组前期的苎麻耐镉基因表达谱分析中,筛选出参与苎麻耐镉的主要代谢途径—谷胱
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植物螯合肽合成酶（phytochelatin synthase,PCS）是参与植物重金属解毒与积累的关键酶。PCS在植物体内以谷胱甘肽（glutathione,GSH）为底物合成植物螯合肽PCs（phytochelatins）,PCs螯合重金属后形成螯合物,缓解了重金属对植物的毒害,在植物解除重金属的毒性方面具有重要作用。课题组前期的苎麻耐镉基因表达谱分析中,筛选出参与苎麻耐镉的主要代谢途径—谷胱甘肽代谢途径的苎麻PCS1,PCS1诱导重金属Cd在叶片中大量表达。为进一步明确苎麻PCS1在苎麻耐镉分子机制中的作用,本研究对苎麻PCS1进行了生物信息学分析,以苎麻叶片cDNA为模板构建了苎麻叶片均一化cDNA文库与pGBKT7-BnPCS1诱饵载体,通过酵母双杂交技术筛选BnPCS1的互作蛋白并进行验证,本试验研究结果如下:1、根据NCBI的GenBank中BnPCS1序列（登录号是KF717368.1）对BnPCS1蛋白进行生物信息学分析,BnPCS1为亲水蛋白,无信号肽及跨膜螺旋区,共含磷酸化位点42个,分子量为56.02 kDa,等电点（pI）为6.76,亚细胞定位预测结果表明BnPCS1位于细胞质。2、使用DSN均一化技术构建了苎麻均一化cDNA文库,文库滴度为3.56×10~6cfu/ml,符合建库要求。随机挑选24个单菌落经AD载体通用引物进行菌落PCR检测,共检测到20个阳性克隆,得到cDNA插入片段在1000bp-2000bp之间,插入片段集中在1000bp上下,重组率为67%。3、构建了pGBKT7-BnPCS1诱饵载体,将pcs-1质粒与酵母表达载体pGBKT7经EcoR I和BamH I双酶切,用T4连接酶连接后,成功构建pGBKT7-BnPCS1质粒。用醋酸锂法将pGADT7空载体和pGBKT7-BnPCS1诱饵载体共同转化至Y2H Gold酵母菌株中,涂布于SD/-Leu/-Trp琼脂板上培养,研究结果表明两者菌落的大小和数目均相近,说明诱饵重组质粒不会对酵母表达产生明显影响。挑取二缺平板上生长较好的单克隆于液体培养基中,在不同浓度的稀释下涂布于SD/-Leu/-Trp、SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp琼脂板培养基上,结果显示没有自激活活性,可用于进一步筛选文库。4、采用酵母双杂交技术从苎麻cDNA文库中筛选得到与BnPCS1互作的蛋白。对杂交菌液SD/-Leu/-Trp的培养板进行涂布稀释1000倍,杂交效率为8.00%,远大于2.00%,并且筛选的文库库容为6.98×10~6 cfu/ml,远大于1.00×10~6cfu/ml,证明酵母双杂交状态良好。以pGBKT7-BnPCS1为诱饵载体,利用酵母双杂系统筛选苎麻全生育期的cDNA文库,将获得的阳性克隆进行测序及序列比对分析,筛库实验中共获得了86个阳性酵母克隆,达到测序要求且测序成功的有18个,经过BLAST比对,最终找到4个可能与BnPCS1互作的蛋白,结果表明它们分别属于4种不同的编码基因蛋白。通过回转试验进一步证明BnPCS1与Clpb3、前体mRNA加工因子39这两个蛋白可发生直接相互作用,表明BnPCS1和这2个蛋白分子相互作用,执行耐镉功能。
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