青蒿素（arteannuin）是1971年由我国科学家从菊花科植物黄花蒿（Artemisia annua Linn）中提取而来的一种天然的倍半萜内过氧化合物。经多方面的研究证实，它是一种非常有效的抗疟药二氢青蒿素（dihydroartemisinin）的前体。根据其研发的第一代药物为半合成的乙缩醛类青蒿素衍生物，其中包括蒿甲醚（artemether）、蒿乙醚（arteether）、青蒿琥酯（artesunat）等等。它们在体内均代谢成为二氢青蒿素，临床上主要用于抗疟治疗。青蒿琥酯为水溶性，与其它同类的药物相比其抗疟作用不但疗效快、毒性小，而且剂型多样，给药方便，因此被广泛应用于恶性疟治疗和危重的脑型疟抢救。近年来国内外学者对青蒿琥酯的药理活性进行了广泛的研究，发现其还具有抗肿瘤、抗病毒、抗纤维化、抗高血压、抗血吸虫、调节免疫等诸多药理活性，尤其是其抗肿瘤作用研究目前正备受瞩目。 与此形成鲜明对比的是，目前涉及其毒理学作用机制的研究深度却十分有限。诚然，青蒿素衍生物在实际临床治疗过程中的毒副作用不太常见，对孕妇也相当安全，且目前的研究也没有明确的证据证明其具有严重的副作用。但是在动物研究中，大剂量青蒿素衍生物可明确表现出神经系统毒副作用和一过性的造血系统抑制现象。国内外学者通过研究初步证实其毒副作用机制与其药理活性具有紧密联系，使其在发挥药理活性过程中杀伤‘敌人’的同时也将造成机体的损伤。从其作用机制推测，青蒿素类药物毒副作用产生的最大原因可能在于其所具有的特殊的分子结构。它被铁离子活化后可释放出各种活性氧簇reactive oxygen species，ROS），产生自由基特异性或非特异性地损伤各种细胞结构，其中包括细胞的遗传物质DNA、各种维持机体正常机能的关键蛋白质、以及维持细胞活性所必需的各种膜类结构和线粒体。除此之外，青蒿琥酯还可通过上调或下调某些功能基因的表达引致细胞正常生理功能紊乱使机体致病。但目前对该类药物的基本毒性作用环节、作用靶标，具体作用方式仍不甚明了，这将严重阻碍青蒿素类药物临床应用的拓展。 为明确了解青蒿素类药物具体的造血毒性作用环节及机制，本课题决定选择水溶性青蒿素衍生物青蒿琥酯作用为研究对象。主要采用小鼠骨髓造血干细胞体外培养作为研究手段，运用多种先进的细胞生物学、分子生物学研究方法进行探索，以期初步阐释青蒿琥酯对造血干细胞的各种毒理学影响，并由此进一步找出其具体的作用靶点，为该类药物不断应用拓展打下基础。 方法： 1．骨髓造血干细胞的培养与鉴定。 取小鼠骨髓造血干细胞进行半固体培养，添加适量EPO（促红细胞生成素）诱导其定向分化为红系造血祖细胞，取造血祖细胞进行联苯胺染色鉴定。 2．青蒿琥酯对造血干细胞定向分化的抑制作用。 取小鼠骨髓造血干细胞进行半固体定向培养并加入不同浓度的青蒿琥酯药物进行干预，其中设一个溶剂对照组；光镜下计数红系集落形成单位（CFU-E）和红系爆式集落形成单位（BFU-E）。 3．青蒿琥酯对细胞内铁代谢的影响。 取小鼠骨髓造血干细胞进行液体定向培养并加入不同浓度的青蒿琥酯药物进行干预，其中设一个溶剂对照组；分别于培养过程中的24h、48h、72h取出细胞进行铁染色，光镜下计数出现铁颗粒的细胞数量及细胞内铁颗粒的数目。 4．青蒿琥酯对小鼠造血干细胞DNA的损伤作用。 取小鼠骨髓造血干细胞进行液体定向培养并加入不同浓度的青蒿琥酯药物进行干预，其中设一个溶剂对照组和一个H2O2阳性对照组；通过单细胞电泳检测、荧光显微镜下计数出现彗尾现象的细胞数目，评估拖尾程度。 5．凝胶电泳检测造血干/祖细胞的凋亡。 取小鼠骨髓造血干细胞进行液体定向培养并加入不同浓度的青蒿琥酯药物进行干预，其中设一个溶剂对照组，分别于药物干预12h、24h后提取细胞DNA作凝胶电泳检测。 6．流式细胞术检测青蒿琥酯诱导的细胞凋亡。 取小鼠骨髓造血干细胞进行液体定向培养并加入不同浓度的青蒿琥酯药物进行干预，其中设一个溶剂对照组，分别于药物干预72h后进行流式细胞术检测。 7．流式细胞术检测青蒿琥酯对骨髓造血干细胞线粒体膜电位的影响。 取小鼠骨髓造血干细胞进行液体定向培养并加入不同浓度的青蒿琥酯药物进行干预，其中设一个溶剂对照组，于药物干预12h后进行流式细胞术检测细胞线粒体膜电位。 8．电镜观察青蒿琥酯诱导的线粒体结构损伤与细胞形态学变化。 取小鼠骨髓造血干细胞进行液体定向培养并加入不同浓度的青蒿琥酯药物进行干预，其中设一个溶剂对照组，于药物干预12h后固定液固定，透射电镜观察细胞形态学和线粒体的改变。 9．ALAS活性的测定。 取成年大鼠肝脏线粒体加入不同浓度的青蒿琥酯药物进行干预，通过核酸蛋白检测仪测定NADH的吸光度（OD值）。 结果： 1．骨髓造血干细胞的培养与鉴定。 造血干细胞分别经过半固体或液体培养，并进行定向诱导分化后的观察结果如下：半固体定向培养细胞在倒置显微镜下观察，红系集落背景稍暗，集落内细胞圆整，体积较小，细胞间紧密连接，因为细胞浆内有血红素合成，集落可呈黄色或红色。液体定向培养细胞在倒置显微镜下观察，红系集落背景稍暗，集落内细胞圆整，体积较小，细胞间连接较紧密，但比半固体培养集落松散，沉积于瓶底，不贴壁，集落周边有散在的形态类似的集落脱落细胞，集落可呈黄色或红色，也可无色。红系造血祖细胞鉴定：细胞经联苯胺与苏木素复染后胞浆呈红褐色，胞核呈紫蓝色。 2．青蒿琥酯对小鼠造血干细胞分化和抑制作用。 半固体定向培养的造血干细胞受药物干预的结果表明，青蒿琥酯能明显抑制造血干细胞向红系造血祖细胞分化，并具有剂量依赖性关系，两个最大剂量组与溶剂对照组比较具有统计学意义（P<0．05）。 3．青蒿琥酯对细胞内铁代谢的影响。 经药物干预的液定向体培养的造血干细胞进行铁染色结果表明，细胞内有铁粒沉积现象，并具有剂量依赖性关系；细胞内沉积的铁粒绝大部分只1～2个，为Ⅰ型沉积；各药物组与溶剂对照组比较均具有统计学意义（P<0．05）。 4．青蒿琥酯对小鼠造血干细胞DNA的损伤作用。 经单细胞电泳实验发现，H2O2阳性对照组细胞可见较明显的慧尾，阴性对照组基本无慧尾出现，各药物组细胞均出现不同程度的慧尾现象，但不如阳性对照组表现明显，多为轻度损伤。 5．凝胶电泳检测造血干/祖细胞的凋亡现象。 凝胶电泳检测结果显示：不同剂量的青蒿琥酯（0．01mmol/L～2．60mmol/L）均可诱导骨髓造血干/祖细胞凋亡，凋亡条带主要分布于500bp至2000bp之间。 6．流式细胞术检测青蒿琥酯诱导的细胞凋亡现象。 流式细胞仪检测发现：青蒿琥酯用药72h后可引起细胞晚期凋亡/死亡，各用药组与溶剂对照组比较均具有统计学意义（P=0．000）；双变量相关分析表明青蒿琥酯剂量与细胞晚期凋亡/死亡率呈正相关（Spearmans：r=0．960，P=0．000）。 7．流式细胞术检测药物对线粒体膜电位（MMP）的影响。 流式细胞仪检测发现：青蒿琥酯可引起造血干/祖细胞MMP显著下降（LSDt-tests各组比较均为P<0．05），且MMP下降程度具有剂量依赖关系；双变量相关分析也表明青蒿琥酯剂量与MMP变化之间呈正显著相关（r=0．546，P=0．018）。 8．电镜观察青蒿琥酯诱导的线粒体结构损伤与细胞形态学变化。 电镜观察结果表明：药物作用后造血干细胞后可见典型的细胞凋亡形态学改变；线粒体出现不同程度的破坏，主要表现为线粒体肿胀，嵴结构模糊或消失，或呈空泡样改变。 9．ALAS活性的测定。 核酸蛋白检测仪测定NADH吸光度，结果表明青蒿琥酯能明显增强ALAS的活性，且各剂量组与溶剂对照组比较均有统计学意义（P<0．05）。 结论： 1．青蒿琥酯能明显抑制造血干细胞向红系造血祖细胞分化；同时可阻碍细胞对铁的利用；诱导细胞DNA损伤； 2．青蒿琥酯能明显破坏造血干/祖细胞线粒体结构，引起线粒体膜电位下降，诱发造血干细胞凋亡。 3．青蒿琥酯可明显增强ALAS的活性，且两者之间具有剂量依赖性关系。