引言：　　肿瘤干细胞(tumor stem cells，TSCs)能够进行自我更新、无限制地生长并能产生异质性的癌细胞。缺氧微环境作为肿瘤干细胞壁龛的重要组成部分，和实体肿瘤的进展和预后密切相关，并影响肿瘤中肿瘤干细胞的演进和抗凋亡能力[1,2]。缺氧诱导因子(Hypoxia Inducible Factor，HIF)家族[3-7]包括HIF-1α和HIF-2α，在这些反应中起着关键作用。近期研究表明，HIF-2α具有双重性，可能是致癌基因，也可能是抑癌基因，在肿瘤的发生发展进程中起着关键作用，而且 HIF-2α基因在肿瘤干细胞中优先表达。研究发现，HIF-2α基因在多种人恶性肿瘤组织中（包括乳腺癌）均呈现高表达[8]，可能涉及包括血管生成、肿瘤侵袭转移、肿瘤干细胞维持、抗凋亡、促进耐药基因的表达等多个方面，从而加速肿瘤恶性转变。　　本研究拟采用生物信息学工具分析 TCGA数据库中1173例乳腺癌测序数据，挖掘与缺氧相关的差异表达基因，寻找与HIF-2α有差异表达关系的基因。通过Knock up/down技术分析相互之间的调控关系，明确HIF-2α在乳腺癌MCF-7细胞中的生物学功能，探索其促进乳腺癌肿瘤干细胞发生的机制。　　第一部分 TCGA数据库挖掘HIF-2α及其表达相关基因在乳腺癌中表达及验证　　目的:　　检测HIF-2α与其表达相关基因TGF-β、SMAD2、OCT4在乳腺癌及癌组织中的表达水平。　　方法:　　利用生物信息学工具挖掘TCGA数据库，分析1173例浸润性乳腺癌标本的测序结果中寻找HIF-2α的表达相关基因及其相关通路，分析各个通路中可能与缺氧及肿瘤干细胞相关的基因；利用TCGA数据库分析HIF-2α在1173乳腺癌组织中的表达情况，探讨其表达程度与病人预后的相关性；采用IHC方法检测45例女性乳腺癌组织中HIF-2α蛋白的表达，并分析其与乳腺癌患者临床病理的关系；采用Real-time PCR法检测45例样本中HIF-2α及其表达相关基因TGF-β、SMAD2、OCT4 mRNA表达情况及与乳腺癌患者临床病理间的关系。　　结果:　　从TCGA数据库中1173例乳腺癌标本测序数据中分析获得165个基因表达与HIF-2α呈正相关，46个基因与HIF-2α呈负相关；与缺氧及肿瘤干细胞形成相关的基因主要聚集在3条路径上：HIF-1 signaling pathway、MAPK signaling pathway、TGF-βsignaling pathway；TCGA预后数据分析显示，HIF-2α高表达对乳腺癌患者来说意味着更差的预后；　　免疫组化结果显示HIF-2α蛋白在乳腺癌组织中的表达显著高于癌旁组织中的表达，并且HIF-2α蛋白在乳腺癌组织中的表达与肿瘤的淋巴结转移之间存在显著相关性 p<0.05；荧光定量 PCR检测 HIF-2α及其表达相关基因 TGF-β、SMAD2、OCT4在乳腺癌组织中的基因表达水平分别为3.7211±1.4000、6.0131±1.1832、4.5751±1.1184显著高于癌旁组织P<0.05，与TCGA数据库分析结果一致。　　小结:　　通过TCGA数据库信息分析结合免疫组化结果发现HIF-2α高表达是乳腺癌不良预后的标志；TGF-β、SMAD2、OCT4是缺氧条件下HIF-2α表达相关基因。　　第二部分 HIF-2α在乳腺癌MCF-7细胞中生物学功能的研究　　目的:　　应用慢病毒感染方法获得MCF-7 HIF-2α knock up/down的稳定细胞株，进一步研究HIF-2α对乳腺癌细胞MCF-7细胞的增殖能力、侵袭能力、克隆形成能力和迁移能力等分子机制的影响；　　方法:　　利用HIF-2α ORF和HIF-2α shRNA慢病毒分别转染MCF-7细胞，筛选构建MCF-7 HIF-2α knock up/down的稳定细胞株；在MCF-7 HIF-2α knock down细胞株上联合CoCl2诱导环境缺氧，利用Realtime-PCR和Western Blot方法分别检测HIF-2α及其表达相关基因（TGF-β、SMAD2和OCT4）mRNA和蛋白的表达水平；利用EdU检测HIF-2α对细胞增殖的影响；利用CCK-8方法检测细胞活力；细胞迁移能力的变化采用细胞划痕实验检测；细胞侵袭能力变化采用Transwell实验检测；细胞的成瘤能力使用平板克隆形成实验检测。　　结果:　　慢病毒感染后，通过筛选获得稳定的MCF-7 HIF-2α Knock up/down细胞株；Real-time PCR和Western blot结果显示在CoCl2诱导的缺氧条件下，HIF-2α及其表达相关基因TGF-β、SMAD2、OCT4表达上调；在MCF-7 HIF-2α knock down细胞株中加入CoCl2，诱导形成缺氧环境，因RNAi的而存在无法上调HIF-2α的表达，而HIF-2α表达相关基因TGF-β、SMAD2、OCT4表达受到抑制；EdU检测结果显示在MCF-7细胞中上调 HIF-2α后，MCF-7细胞的增殖能力增强，即HIF-2α的高表达促进MCF-7细胞增殖；CCK-8检测证实HIF-2α高表达增强细胞活力，促进MCF-7肿瘤细胞增殖；细胞划痕实验表明HIF-2α高表达促进MCF-7肿瘤细胞迁移；Transwell小室实验显示HIF-2α高表达促进MCF-7肿瘤细胞的侵袭能力增强；平板克隆形成实验表明HIF-2α高表达促进MCF-7细胞成瘤。　　小结:　　HIF-2α与TGF-β、SMAD2和OCT4表达具有相关性，且HIF-2α能够增加细胞活力，促进细胞增殖和侵袭迁移；　　第三部分 HIF-2α对乳腺癌肿瘤干细胞形成的影响　　目的：　　探讨HIF-2α表达对低氧下乳腺癌肿瘤干细胞特性（Breast Cancer Stem Cells，BCSCs）的影响。　　方法：　　采用免疫磁珠法得到人乳腺癌 MCF-7干细胞株，感染慢病毒获得 MCF-7 CSCs HIF-2α knock up/down细胞株；Realtime-PCR和Western blot检测HIF-2α、TGF-β、SMAD2、OCT4 mRNA及蛋白在MCF-7 CSCs、MCF-7 CSCsHIF-2α knock up/down细胞株中表达的变化；CCK-8检测试剂盒检测HIF-2α对MCF-7 CSC细胞增殖活力的影响；　　CoCl2联合无血清悬浮培养法培养MCF-7 knock up/down细胞株，诱导获得“乳腺癌肿瘤干细胞（Breast Cancer Stem Cells，BCSCs）微球体”；流式细胞仪被用来检测细胞的凋亡及乳腺癌肿瘤干细胞标志物 CD44+的表达；裸鼠荷瘤实验比较MCF-7 Knock up/down肿瘤干细胞的肿瘤生长速度，及成瘤能力。　　结果：　　采用表面抗体标记磁纳米颗粒法分选获得的乳腺癌MCF-7干细胞经慢病毒感染后筛选获得MCF-7 CSC HIF-2α knock up/down细胞株；Real-time PCR和Western blot结果显示在MCF-7 CSC HIF-2α knock up细胞株中，HIF-2α及表达相关基因TGF-β、SMAD2、OCT4表达上调；在MCF-7 HIF-2α knock down细胞株中因RNAi存在而抑制HIF-2α的表达，HIF-2α表达相关基因TGF-β、SMAD2、OCT4表达变化无统计学意义；　　流式细胞术检测MCF-7 CSC HIF-2α knock up/down经CoCl2联合无血清悬浮培养的微球体中乳腺癌肿瘤干细胞标志物CD44+细胞比例显示，MCF-7 HIF-2α knock up细胞株形成微球体中CD44+细胞比例（91.07％）显著高于MCF-7（79.21%）和MCF-7 HIF-2α knock down细胞株（51.6%）；CCK-8检测结果显示：HIF-2α过表达促进MCF-7 CSC增殖；流式细胞术检测结果显示：HIF-2α过表达抑制MCF-7干细胞的凋亡；HIF-2α过表达的MCF-7干细胞成瘤能力明显高于正常MCF-7干细胞和HIF-2α下调的MCF-7干细胞。　　小结：　　缺氧环境下上调HIF-2α能够促进MCF-7肿瘤干细胞的形成，并有促增殖作用和抑制MCF-7肿瘤干细胞凋亡，上调MCF-7肿瘤干细胞TGF-β、SMAD2和OCT4蛋白和mRNA的表达。裸鼠荷瘤实验证实HIF-2α过表达明显增加MCF-7肿瘤干细胞的成瘤能力。　　结论　　1．乳腺癌组织中HIF-2α过表达，可能与乳腺癌的预后相关；　　2、在缺氧微环境中TGF-β、SMAD2、OCT4是HIF-2α的表达相关基因；　　3、在乳腺癌MCF-7细胞及MCF-7干细胞中过表达HIF-2α能够增强细胞活力，促进细胞增殖，增加肿瘤细胞的侵袭、迁移和成瘤能力；　　4、缺氧条件下，上调MCF-7细胞中HIF-2α的表达，能够促进MCF-7 CSCs的发生；　　5、HIF-2α过表达的MCF-7 CSCs成瘤能力明显高于正常MCF-7 CSCs和HIF-2α下调的MCF-7 CSCs。