第一部分胶原蛋白结合肽CBP1495肝纤维化显像研究背景:肝纤维化是各种病因引起的肝实质细胞减少与纤维组织增多,如果得不到有效控制,将最终发展为肝硬化,导致肝功能衰竭,甚至机体死亡。肝纤维化在早期阶段是可逆的,而且不同程度的肝纤维化需要不同的治疗方案。因此,肝纤维化的早期诊断、定量评价、进展监测及疗效评估对指导肝纤维化治疗至关重要。影像学检查是肝纤维化诊断与评估的重要手段,但常规的超声、CT和MR等解剖影像难以依据形态改变早期诊断肝纤维化。以¹⁸F-FDG为代表的现有放射性核素影像虽可用于评估肝纤维化病变的活动性与预后,但显示的是肝纤维化造成的代谢异常、组织炎症等间接征象,不具有特异性。因此,目前还缺少一种理想的、可靠的肝纤维化显像方式。研制能够显示肝纤维化特征性病理改变的新型分子显像剂可能是解决上述问题的有效途径。肝纤维化的主要病理特点是细胞外基质（ECM）中胶原蛋白（主要是I型胶原蛋白）的大量堆积,而且I型胶原蛋白堆积量与纤维化的严重程度呈正相关。因此,I型胶原蛋白是肝纤维化显像的理想靶标。基质金属蛋白酶-2（MMP-2）能够结合并降解I型胶原蛋白。我们在研究中发现MMP-2前体中含有MMP-14酶切位点的多肽片段CPKESCNLFVLKD（以下简称CBP1495）能够与I型胶原蛋白以较高的亲和力结合。靶向I型胶原蛋白的多肽分子,因其分子量小,血管与组织穿透性好,血浆清除速度快及低免疫原性等特点,适合作为肝纤维化的体内示踪剂。因此,本研究拟进一步鉴定CBP1495靶向I型胶原蛋白的能力,并构建CBP1495分子探针进行大鼠肝纤维化模型显像研究,为该分子探针用于肝纤维化的诊断与评估奠定理论依据与实验基础。研究方法:1.应用等温滴定量热法（ITC）分析CBP1495与溶液中的I型胶原蛋白或胶原蛋白模拟肽（GPO）9的亲和力,ELISA分析生物素标记CBP1495（biotin-CBP1495）与固相包埋的I型胶原蛋白的亲和力;2.Western blot及组织学染色鉴定biotin-CBP1495靶向I型胶原蛋白或胶原纤维的能力;3.制备放射性核素^99mTc标记的CBP1495分子探针,并鉴定其标记率、体外稳定性、血清蛋白结合率、放化纯度（RCP）、油水分配系数等理化性质;4.研究^99mTc-CBP1495在健康动物体内的示踪动力学、动态与静态显像以及在动物各主要脏器的分布情况;5.以CCl4构建大鼠肝纤维化模型并行组织病理学鉴定,以组织化学染色鉴定biotin-CBP1495靶向纤维化病变组织的能力;6.以^99mTc-CBP1495为分子探针,行肝纤维化大鼠模型的针孔探头平面显像及SPECT/CT断层融合显像;7.离体测定大鼠模型肝组织的^99mTc-CBP1495摄取率与代表纤维化程度的羟脯氨酸（Hyp）含量,评价^99mTc-CBP1495的摄取率与Hyp含量的相关性。研究结果:1.CBP1495能够以较高的亲和力结合溶液中的I型胶原蛋白（Kd=6.54μM）或（GPO）9（Kd=0.633μM）,以及固相包埋的I型胶原蛋白（Kd=0.861μM）;2.Western Blot分析显示biotin-CBP1495能够染出I型胶原蛋白4条泳带中的3条;组织化学染色结果表明biotin-CBP1495可以阳性显示大鼠尾皮肤及小鼠肌腱组织中的胶原纤维;3.制备了标记率为95.06±1.08%（n=6）的^99mTc-CBP1495,在室温下的生理盐水或37℃人血清中放置8 h后的RCP>90%,放置24 h RCP仍>85%;^99mTc-CBP1495与血清蛋白均没有明显结合,其油水分配系数为-3.473±0.014（n=3）;4.^99mTc-CBP1495在健康大耳兔（n=6）体内的示踪动力学过程符合权重为1/C的三室模型,血液放射性浓度C（k Bq/L）与注射标记多肽后的时间t（min）关系式为:C（t）=1474.001e-0.57t+358.843e-0.028t+92.985e-0.004t;在大耳兔体内的静态与动态显像以及在健康小鼠体内的分布实验显示:（1）^99mTc-CBP1495通过泌尿系统排泄,不通过肝胆系统排泄;（2）给药120 min后,^99mTc-CBP1495在血、脑、甲状腺、心、肝、脾、肾、胃、小肠、肌肉及骨等器官或组织中的分布都稳定在低水平,心、肝影像呈稍强于肌肉软组织本底的淡影;（3）^99mTc-CBP1495在体内240 min未解离产生游离^99mTc;5.组织病理学结果证实成功构建了大鼠肝纤维化模型,组织化学染色表明biotin-CBP1495可以阳性显示肝组织内增生的胶原纤维;6.针孔探头平面显像示大鼠模型的纤维化肝脏较正常肝脏异常高摄取^99mTc-CBP1495,而SPECT/CT断层融合显像进一步明确了上述结果;7.离体定量分析显示靶与非靶比值（纤维化肝/心）为8.70±2.11（n=6）,肝脏对^99mTc-CBP1495的摄取率与肝组织纤维化程度（Hyp含量）呈正比（P<0.0001,r2=0.7581）。研究结论:通过以上研究,我们证实了CBP1495是一个新型胶原蛋白结合肽,能够以较高的亲和力结合I型胶原蛋白或（GPO）9,可体外靶向I型胶原蛋白与胶原纤维。我们成功构建了标记率与放化纯度高、体内外稳定性好的^99mTc-CBP1495分子探针,该分子探针血浆清除速率快,显像软组织本底低,仅从泌尿系统排泄而不经肝胆系统排泄,有利于实施在体分子成像。以^99mTc-CBP1495为探针的SPECT/CT分子成像能够在体显示大鼠肝纤维化,并且肝组织摄取^99mTc-CBP1495与肝纤维化程度呈显著正相关。因此,^99mTc-CBP1495是一个具有潜在临床价值的肝纤维化诊断与定量分子显像剂。第二部分胰腺癌MMP-14活化环状CBP1495的初步研究研究背景:精确放疗是中晚期胰腺癌患者的重要治疗手段,而根据肿瘤影像进行准确定位与靶区勾画是胰腺癌精确放疗的基础。但是CT、MR等常规影像检查勾画的解剖学靶区往往小于肿瘤实际侵犯的生物学靶区。以¹⁸F-FDG PET为代表的肿瘤代谢显像,虽能够为精确放疗提供癌组织中的高代谢生物靶区,但难以鉴别炎症等高代谢病灶造成的假阳性。因此,目前用于临床的影像学检查在指导胰腺癌精确放疗方面都存在一定局限性,研发靶向胰腺癌的新型分子显像探针是解决该问题的有效途径,而胰腺癌特异靶点的选择与分子探针的设计是构建胰腺癌新型分子显像探针的两个关键因素。不同于其它多数类型的肿瘤,胰腺癌纤维化是一个普遍现象。因为I型胶原蛋白是胶原纤维的主要标志分子,所以I型胶原蛋白在胰腺癌组织中的表达也是显著增多的,而且I型胶原蛋白具有促进胰腺癌侵袭转移的作用,其表达水平越高,发生转移的风险越高,患者的预后也约差。因此,I型胶原蛋白是胰腺癌分子显像的重要靶点。但是,由于胰腺的慢性炎症也可能会伴有纤维化病变,所以直接靶向I型胶原蛋白的分子探针会缺乏胰腺癌显像特异性。胰腺癌组织中的I型胶原蛋白与MMP-14能相互促进表达上调。在胰腺癌富含胶原蛋白的微环境中,MMP-14能够促进肿瘤增殖、侵袭与转移。MMP-14在胰腺癌组织中异常高表达,而在正常胰腺组织或胰腺癌旁组织中不表达或低表达,瘤/非瘤比值高。因此,MMP-14也是胰腺癌分子显像的靶点。在上一部分的研究中,我们发现含有MMP-14酶切位点的CBP1495能够与I型胶原蛋白高亲和力结合,并以^99mTc-CBP1495为分子探针成功在体显示了大鼠肝或肺纤维化。后续研究中,为提高CBP1495在体内的稳定性与血液循环时间,我们构建了首尾酰胺环化的CBP1495（c CBP1495）。但意外的在ITC分析中发现c CBP1495与I型胶原蛋白或（GPO）9没有明显的结合能力,而c CBP1495经MMP-14酶切的产物c CBP1495-d却具有与I型胶原蛋白或（GPO）9的结合能力。根据以上研究结果,我们推测c CBP1495可作为一个由MMP-14酶切激活的可活化胶原蛋白结合肽:当丧失了胶原蛋白结合能力的c CBP1495被胰腺癌高表达的MMP-14酶切后,形成线状形态的c CBP1495-d,继而恢复与I型胶原蛋白的结合能力,然后锚定于胰腺癌组织高表达的胶原纤维上并逐渐聚集。因为胰腺癌具有MMP-14与I型胶原蛋白均异常高表达的特点,所以如果成功构建出我们设想的既需要MMP-14活化又继而靶向I型胶原蛋白的c CBP1495分子探针,则有望实现高靶/非靶比值的胰腺癌特异性分子显像。基于上述分析,我们拟进一步明确胰腺癌MMP-14表达情况及其临床价值,然后比较c CBP1495及其MMP-14酶切产物c CBP1495-d靶向I型胶原蛋白的能力,在体外初步评价MMP-14和高表达MMP-14的胰腺癌细胞对c CBP1495的活化作用,为下一步构建c CBP1495分子探针并进行胰腺癌体内显像研究提供理论基础与实验依据。研究方法:1.免疫组化染色分析68对人胰腺癌组织及癌旁组织MMP-14的表达情况;Western blot检测8对人胰腺癌与癌旁组织,以及胰腺癌细胞株Bxpc-3与正常胰腺导管上皮细胞株HPDE的MMP-14表达水平,并半定量分析瘤/非瘤比值;2.收集了上述68位胰腺癌患者的临床病理资料,分析MMP-14的表达水平（免疫组化结果评分）与胰腺癌患者临床病理特征及预后的关系;3.ITC分析biotin-c CBP1495和biotin-c CBP1495-d与溶液中的I型胶原蛋白或胶原蛋白模拟肽（GPO）9的亲和力,ELISA分析biotin-c CBP1495和biotin-c CBP1495-d与固相包埋的I型胶原蛋白的亲和力;4.Western blot及组织学染色比较biotin-c CBP1495和biotin-c CBP1495-d靶向I型胶原蛋白或胶原纤维的能力;5.高效液相色谱偶联质谱（HPLC-MS）鉴定MMP-14酶切biotin-CBP1495的活性;6.ELISA实验评价MMP-14和高表达MMP-14的胰腺癌细胞株Bxpc-3对biotin-c CBP1495的活化作用。研究结果:1.免疫组化分析显示胰腺癌的MMP-14表达水平显著高于癌旁组织（P<0.0001）;Western blot分析显示胰腺癌与癌旁组织的MMP-14表达水平比值高（4.54²9.31,14.13±7.45,n=8）;MMP-14在Bxpc-3中呈高表达,而在HPDE中微弱表达,两者具有显著差异（P=0.0013）;2.胰腺癌的MMP-14表达水平与转移（包括淋巴结与远处转移,P=0.013）、TNM分期（P=0.021）及患者预后密切相关（P=0.034）;3.biotin-c CBP1495不能结合I型胶原蛋白;biotin-c CBP1495-d能够结合溶液中的I型胶原蛋白（Kd=31.5μM）或（GPO）9（Kd=2.00μM）以及固相包埋的I型胶原蛋白（Kd=5.797μM）。4.Western Blot与组织化学染色显示biotin-c CBP1495的结果均为阴性,biotin-c CBP1495-d能够染出I型胶原蛋白4条泳带中的2条,并且能够阳性显示正常或纤维化大鼠肺组织中的胶原纤维,但染色强度较biotin-CBP1495弱;5.HPLC-MS分析显示biotin-CBP1495能够在体外被MMP-14有效酶切;6.ELISA分析显示,在体外与MMP-14或高表达MMP-14的胰腺癌细胞Bxpc-3作用2小时后,部分biotin-c CBP1495发生活化,显示出与I型胶原蛋白的结合能力;研究结论:通过以上研究,我们证实了MMP-14在胰腺癌中异常高表达,瘤/非瘤比值高。MMP-14的表达水平与胰腺癌的转移、分期密切相关,MMP-14高表达是胰腺癌的不良预后因素。因此MMP-14是胰腺癌分子显像的理想靶标。进一步研究显示呈首尾酰胺环化的c CBP1495不能结合I型胶原蛋白,但能被胰腺癌高表达的MMP-14酶切后形成线性的c CBP1495-d,并部分恢复靶向I型胶原蛋白或胶原纤维的功能。因此,我们的研究初步证明c CBP1495能够在体外被胰腺癌细胞高表达的MMP-14酶切活化为具有I型胶原蛋白靶向功能的c CBP1495-d,为进一步构建c CBP1495分子探针及其胰腺癌活体成像研究奠定了理论基础。