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第一部分下调RbAp48表达抑制肿瘤细胞增殖的机制研究目的:RbAp48属于WD蛋白家族,是一个存在于几乎所有真核生物中高度保守的蛋白。我们前期研究发现,下调RbAp48表达可诱导人肺癌、宫颈癌、胃癌、大肠癌等多种肿瘤细胞发生周期阻滞并抑制其增殖,然而其作用机制尚不清楚,为此我们进行研究。方法:以RNA干扰技术下调目的蛋白的表达;以全基因组测序法检测下调RbAp48表达后对细胞基因表达的影响,以GO和KEGG对差异表达基因进行分析;Western blot检测下调RbAp48表达后蛋白的改变;MTT法检测下调及过表达(慢病毒载体构建)目的蛋白对siRbAp48抑制细胞增殖能力的影响。结果:1.测序显示以siRbAp48下调A549细胞RbAp48的表达后有468个基因的表达发生改变,其中164个基因表达下调,304个基因表达上调。GO分析表明下调RbAp48表达后影响最显著的功能是调节细胞增殖(P=4.07E-05,校正P=0.035);KEGG分析显示与非小细胞肺癌通路相关的56个基因中,CCND1(编码CyclinD1蛋白)与下调RbAp48密切相关。2.Western blot证实下调RbAp48的表达后肺癌A549、宫颈癌Hela细胞中CyclinD1的表达显著降低。MTT结果显示以慢病毒载体构建过表达CCND1后能显著拮抗siRbAp48对A549、Hela细胞增殖的抑制作用。3.以siRbAp48下调胃癌HGC-27、大肠癌HT-29细胞中RbAp48表达后,其CyclinD1的表达并未发生明显下调,显示其抑制细胞增殖的作用并不是通过下调CyclinD1实现的。但下调RbAp48表达后能显著下调HGC-27和HT-29细胞中Cdc25C的表达,以慢病毒载体构建过表达Cdc25C能显著拮抗siRbAp48对HGC-27和HT-29细胞增殖的抑制作用。结论:1.下调CyclinD1的表达是siRbAp48抑制人肺癌A549、宫颈癌Hela细胞增殖的主要途径。2.下调Cdc25C的表达是siRbAp48抑制人胃癌HGC-27、大肠癌HT-29细胞增殖的主要途径。第二部分下调RbAp48表达提高肿瘤细胞顺铂敏感性的机制研究目的:我们前期研究发现下调RbAp48表达能显著提高A549耐药株细胞对顺铂的敏感性,基于全基因组测序研究的结果,我们对下调RbAp48提高肿瘤细胞顺铂敏感性的作用机制进行了研究。方法:MTT法检测细胞对顺铂的敏感性;原子吸收分光光度法测定细胞内铂含量;MTT法检测下调及过表达目的蛋白(慢病毒载体构建)对顺铂敏感性的影响。结果:1.以siRbAp48下调RbAp48的表达显著提高肺癌A549、宫颈癌Hela细胞对顺铂敏感性,而以慢病毒载体导入外源性过表达RbAp48可显著降低siRbAp48对顺铂敏感性的干预作用。2.下调RbAp48的表达后,并未引起肿瘤细胞中铂含量的变化;绝大多数现已知与顺铂耐药相关的基因也未发生明显改变;但CyclinD1的表达明显降低。3.以siRNA下调CyclinD1的表达能显著提高细胞对顺铂的敏感性。而过表达CyclinD1可拮抗siRbAp48对顺铂敏感性的调节作用。结论:下调RbAp48通过抑制CyclinD1的表达而显著提高A549、Hela细胞对顺铂的敏感性。