背景人体骨骼肌约占总体重的40%。维持健康的骨骼肌对于机体运动、预防代谢紊乱和促进健康老龄化至关重要。肌肉衰减症是一种与增龄相关的进行性骨骼肌质量下降,伴有肌力和(或)肌肉功能减退的综合性退行性病症。它会导致老年人身体功能下降、虚弱、跌倒等,严重影响老年人群的生活质量。越来越多的证据表明,肥胖和饱和脂肪酸是肌肉衰减症的独立危险因素,可促进肌肉衰减的发生发展。这种老年人群中肌肉质量减少的同时伴有脂肪堆积过多的症状,近年来被定义为肥胖性肌肉衰减症。与单纯的肌肉衰减症或单纯的肥胖相比,肥胖性肌肉衰减症患者代谢综合征和心血管疾病的发生风险以及死亡率增加。随着全球人口老龄化的加剧和肥胖患病率的不断上升,肥胖性肌肉衰减症已经成为一个严重的公共卫生问题,给养老服务机构和医疗卫生服务系统带来沉重的负担。目前,肥胖性肌肉衰减症的病理生理机制还不十分清楚,并且还没有理想的防治措施。因此,为促进健康老龄化和延长预期寿命,迫切需要进一步研究肥胖性肌肉衰减症的病理生理过程和探寻安全有效的防治策略。近年来,越来越多的研究表明线粒体功能紊乱和氧化应激在肌肉衰减症的发生发展中起重要作用。另外,有研究表明骨骼肌异位脂质沉积会导致代谢异常以及肌肉质量和功能的下降。骨骼肌细胞内脂质及其中间代谢产物的过度蓄积可形成脂毒性环境,导致线粒体功能受损以及活性氧生成增加。而线粒体是脂肪酸氧化的重要场所,线粒体功能损伤会引起脂肪酸氧化能力下降,导致细胞内脂质进一步的累积,从而形成脂毒性和线粒体功能紊乱的恶性循环。因此,阐明线粒体功能紊乱、氧化应激和骨骼肌脂质沉积在肥胖性肌肉衰减症发生发展中的作用及其分子调控机制,以及探索减轻线粒体功能紊乱、氧化应激和脂质沉积的策略,可能对于肥胖性肌肉衰减症的防治具有重要意义。腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)是细胞内的能量代谢感受器,在调节骨骼肌线粒体功能和氧化应激中发挥关键作用。肝激酶B1(Liver kinase B1,LKB1)是AMPK上游主要的蛋白激酶,已被证实可调节骨骼肌的线粒体生物合成和抗氧化途径。蛋白激酶A(Protein kinase A,PKA)可以磷酸化LKB1的Ser431位点,进而激活LKB1。因此,靶向调控PKA/LKB1/AMPK信号通路可能是改善骨骼肌线粒体功能和氧化应激的有效途径。然而,PKA/LKB1/AMPK信号通路在肥胖性肌肉衰减症中的作用尚不清楚。肉碱棕榈酰转移酶-1(Carnitine palmitoyl transferase-1,CPT-1)是线粒体脂肪酸氧化过程中重要的限速酶,它催化长链脂肪酸转运至线粒体中进行β-氧化。骨骼肌中过表达CPT-1可以增强脂肪酸氧化进而减少骨骼肌脂质沉积。过氧化物酶体增殖物激活受体δ(Peroxisome proliferator-activated receptor-delta,PPARδ)是配体激活的转录因子,是代谢综合征相关疾病药物治疗的潜在靶点。PPARδ激动剂可通过增加骨骼肌细胞中PPARδ靶基因CPT-1的表达,促进脂肪酸氧化,进而抑制骨骼肌中脂质沉积。因此,PPARδ/CPT-1信号通路有望成为改善骨骼肌异位脂质沉积的药物靶点。然而,PPARδ/CPT-1信号通路在肥胖性肌肉衰减症模型中的作用尚未见报道。虽然已经发现了一些肌肉萎缩的潜在药物干预靶点,但是目前临床上还没有一种药物被批准用于肌肉衰减症的治疗。尽管一些研究发现生长激素释放肽、胰岛素样生长因子I、克伦特罗和睾酮等几种药物可以对几种情况下的肌肉萎缩产生效应,但是由于其潜在的副作用,如水钠潴留、心律失常、前列腺肥大、胰岛素抵抗等,它们的临床应用受到限制。因此,需要进一步研究开发有效、安全的防治肌肉衰减症的药物。天然产物是自然界的生物在进化过程保存下来的次级代谢产物,是治疗疾病的重要药物来源。与合成药物相比,许多药用植物和天然产品更加安全和经济有效。白藜芦醇(Resveratrol,RSV)是一种存在于许多植物中的天然多酚类化合物,具有抗氧化、抗炎症、抗动脉粥样硬化和抗肿瘤等多种药理学作用。近年来,有研究表明RSV可以抑制糖皮质激素、阿霉素、肿瘤坏死因子α和血管紧张素诱导的蛋白质降解和肌肉萎缩,也能改善恶病质、糖尿病和慢性肾脏疾病等几种病理状态下的肌肉衰减。但是RSV对肥胖性肌肉衰减症的效应还未见报道。体内和体外实验都证实了RSV能通过激活AMPK信号通路进而改善骨骼肌细胞的线粒体功能和氧化应激。RSV也可以激活PKA/AMPK信号通路进而改善高脂诱导的肝脂肪变性。此外,有研究报道RSV可通过激活PPARδ对内皮细胞和视网膜色素上皮细胞产生保护作用。综合上述分析,我们提出如下假说:RSV可通过PKA/LKB1/AMPK通路减轻骨骼肌线粒体功能紊乱和氧化应激,以及通过PPARδ/CPT-1通路抑制骨骼肌异位脂质沉积,进而改善肥胖性肌肉衰减症。为了验证这一假设,我们观察了RSV对高脂诱导的老年大鼠肥胖性肌肉衰减症和棕榈酸(Palmitic acid,PA)诱导的肌管细胞萎缩的影响,并深入探讨PKA/LKB1/AMPK信号通路在RSV调节骨骼肌线粒体功能和氧化应激中的作用,以及PPARδ/CPT-1信号通路在RSV调控骨骼肌脂质沉积中的作用。方法一、RSV对肥胖性肌肉衰减症体内外模型肌萎缩的影响1.将50只18月龄的老年雄性SD大鼠随机分为以下五组:(1)O组:老年大鼠用普通饲料喂养20周;(2)HO组:老年大鼠用高脂饲料喂养20周;(3)HO+R10组:老年大鼠用高脂饲料喂养10周后,再用添加了0.4%RSV的高脂饲料继续喂养10周;(4)R20+HO组:老年大鼠用添加了0.4%RSV的高脂饲料喂养20周;(5)R20+O组:老年大鼠用添加了0.4%RSV的普通饲料喂养20周(R20+O)。另外,选取10只3月龄的雄性SD大鼠作为年轻对照组,并用普通饲料喂养20周。用抓力测量仪测量抓力。用小动物CT成像系统分析机体脂肪含量。在20周的实验周期结束时,在麻醉下处死大鼠。收集血液,用自动分析仪测定血清生化指标。取骨骼肌组织称重和进行苏木精和伊红染色。使用ImageJ软件测量肌纤维横截面积。2.大鼠L6成肌细胞分化成肌管细胞后,用0.75 mM的PA单独或与25μM的RSV共同处理L6肌管细胞24 h,之后细胞用于后续实验。细胞活力用CCK-8检测试剂盒测定。用免疫印迹法测定肌球蛋白重链(Myosin heavy chain,MHC)的蛋白水平。用ImageJ软件测量肌管直径。二、RSV对肥胖性肌肉衰减症体内外模型骨骼肌线粒体功能、氧化应激和蛋白质代谢的调控作用及机制研究1.RSV对骨骼肌线粒体功能、氧化应激和蛋白质代谢的影响1.1用透射电镜观察大鼠腓肠肌的线粒体形态;用MitoTracker探针标记肌管细胞线粒体,观察细胞线粒体形态。1.2采用实时荧光定量PCR技术测定大鼠腓肠肌和L6肌管细胞中线粒体DNA(Mitochondrial DNA,mtDNA)的拷贝数。1.3用JC-1探针测定大鼠腓肠肌和L6肌管细胞的线粒体膜电位水平;使用生物能量分析仪测定肌管细胞的耗氧率;用酶联免疫分析试剂盒检测大鼠腓肠肌和L6肌管细胞的线粒体呼吸链酶复合物I、II和IV的活性。1.4用活性氧(Reactive oxygen species,ROS)检测试剂盒测定肌管细胞中总的ROS水平;用线粒体超氧化物红色荧光探针标记线粒体衍生的超氧阴离子,检测肌管细胞中线粒体活性氧含量;用相应的试剂盒测定大鼠腓肠肌和L6肌管细胞中抗氧化酶活性、总抗氧化能力、丙二醛含量和羰基化蛋白水平。1.5用免疫印迹法测定线粒体生物合成的关键调节因子过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1α(Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma coactivator-1 alpha,PGC-1α)和线粒体转录因子A(Mitochondrial transcription factor A,TFAM)以及线粒体融合蛋白2(Mitofusin-2,mfn2)和动力相关蛋白1(Dynamin-related protein 1,drp1)的表达水平。1.6通过免疫印迹法测定蛋白质代谢相关因子的表达水平。2.PKA/LKB1/AMPK信号通路在RSV调控骨骼肌线粒体功能、氧化应激和蛋白质代谢中的作用2.1用免疫印迹法测定大鼠腓肠肌和L6肌管细胞中PKA/LKB1/AMPK通路相关蛋白的表达水平,并使用siRNA干扰技术,明确RSV对PKA/LKB1/AMPK信号通路的影响。2.2用PKA siRNA、LKB1 siRNA和AMPK siRNA转染肌管细胞,探讨PKA/LKB1/AMPK信号通路在RSV调控骨骼肌线粒体功能、氧化应激和蛋白质代谢中的作用。3.减轻线粒体功能紊乱和氧化应激对RSV改善骨骼肌蛋白质代谢和肌萎缩的影响3.1用TFAM siRNA、mfn2 siRNA和drp1 siRNA转染肌管细胞,通过检测呼吸耗氧率来反映线粒体功能;并通过测定蛋白质代谢相关因子和MHC的表达水平以及肌管直径,阐明线粒体功能紊乱在肥胖性肌肉衰减症发生发展中的作用,并探究线粒体功能调节在RSV改善骨骼肌蛋白质代谢和肌萎缩中所发挥的作用。3.2用ROS清除剂N-乙酰-L-半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine,NAC)以及线粒体靶向抗氧化剂MitoTEMPO处理L6肌管细胞,通过检测总ROS水平来反映氧化应激水平;并通过测定蛋白质代谢相关因子和MHC的表达水平以及肌管直径,阐明氧化应激在肥胖性肌肉衰减症发生发展中的作用,并探讨减轻氧化应激对RSV改善骨骼肌蛋白质代谢和肌萎缩的影响。三、RSV对骨骼肌异位脂质沉积的调控作用及机制研究1.用试剂盒测定大鼠腓肠肌和L6肌管细胞中甘油三酯(Triglyceride,TG)含量。2.用免疫印迹法测定大鼠腓肠肌和L6肌管细胞中PPARδ和CPT-1的蛋白表达水平,并使用PPARδsiRNA和PPARδ激动剂处理肌管细胞,研究RSV对PPARδ/CPT-1信号通路的影响。3.用PPARδsiRNA和CPT-1 siRNA转染肌管细胞,通过检测TG水平、MHC蛋白水平和肌管直径,探讨PPARδ/CPT-1通路在RSV调控骨骼肌脂质沉积、改善肌萎缩中的作用。主要的实验结果和结论一、RSV改善高脂诱导的肥胖性肌肉衰减症和PA诱导的肌细胞萎缩1.高脂喂养明显导致老年大鼠体脂含量增加,骨骼肌质量减少,肌纤维横截面积减小,抓力下降,提示老年大鼠肥胖性肌肉衰减症模型建立成功;RSV干预可抑制高脂诱导的老年大鼠脂肪蓄积以及肌肉质量和肌纤维横截面积的下降,并提升抓力,表明RSV能有效改善高脂诱导的肥胖性肌肉衰减症。2.PA处理的L6肌管细胞中MHC蛋白水平和肌管直径显著降低,提示肌细胞萎缩模型建立成功;RSV处理可抑制PA诱导的MHC水平和肌管直径的减少,表明RSV能改善PA诱导的肌细胞萎缩。二、RSV通过PKA/LKB1/AMPK通路减轻骨骼肌线粒体功能紊乱和氧化应激,进而改善蛋白质代谢,防治高脂和PA诱导的肌萎缩1.RSV通过PKA/LKB1/AMPK通路改善骨骼肌线粒体功能、氧化应激和蛋白质代谢1.1 RSV干预可以抑制高脂和PA诱导的骨骼肌中p-PKA/PKA、p-LKB1/LKB1和p-AMPK/AMPK比值的下降。LKB1 siRNA转染肌管细胞后,RSV诱导的LKB1活化作用被削弱,同时p-AMPK/AMPK的比值下降;PKA siRNA转染肌管细胞后,RSV诱导的PKA活化作用被抑制,同时p-LKB1/LKB1和p-AMPK/AMPK的比值下降。这些结果表明RSV可以激活骨骼肌中PKA/LKB1/AMPK信号通路。1.2在高脂诱导的肥胖性肌肉衰减症模型和PA诱导的肌细胞萎缩模型中,RSV干预可促进骨骼肌线粒体生物合成,维持线粒体动力学,改善线粒体形态,抑制mtDNA含量的减少,防止线粒体膜电位下降,恢复线粒体呼吸功能,提升线粒体呼吸链酶复合物活性,增强抗氧化能力,并降低丙二醛和蛋白质羰基化水平。而使用PKA siRNA,LKB1siRNA和AMPK siRNA转染肌管细胞后,RSV的这些作用被阻断,说明RSV可通过PKA/LKB1/AMPK信号通路改善骨骼肌线粒体功能和氧化应激。1.3在高脂喂养的老年大鼠骨骼肌和PA处理的肌管细胞中,RSV干预可抑制蛋白质降解的增加以及蛋白质合成的下降。而用PKA siRNA、LKB1 siRNA和AMPK siRNA转染肌管细胞后,RSV的上述作用被削弱。另外,PKA siRNA、LKB1 siRNA和AMPK siRNA阻断了RSV抑制PA诱导的MHC蛋白水平和肌管直径下降的作用。上述结果表明RSV可通过PKA/LKB1/AMPK信号通路改善蛋白质代谢,进而抑制肌萎缩。2.RSV通过减轻骨骼肌线粒体功能紊乱和氧化应激改善蛋白质代谢和肌萎缩2.1 TFAM siRNA和mfn2 siRNA转染肌管细胞后,RSV恢复线粒体呼吸功能的作用被削弱,同时RSV对蛋白质代谢相关因子和MHC蛋白表达水平以及肌管直径的调节作用被抑制。DRP1 siRNA转染肌管细胞可提高线粒体呼吸能力,同时改善PA诱导的蛋白质代谢失衡和肌萎缩,产生与RSV干预细胞类似的效应。这些结果表明线粒体功能紊乱在肥胖性肌肉衰减症的发生发展中起重要作用;RSV可通过改善骨骼肌线粒体功能抑制蛋白质降解和促进蛋白质合成,进而抑制肌萎缩。2.2 NAC和MitoTEMPO能明显抑制PA诱导的肌管细胞中ROS水平的上升。另外,NAC和MitoTEMPO对肌管细胞中蛋白质代谢相关因子的表达水平以及肌萎缩的影响与RSV相似。上述结果提示氧化应激可以促进肥胖性肌肉衰减症的发生发展;RSV能通过减轻骨骼肌氧化应激改善蛋白质代谢,进而抑制肌萎缩。三、RSV通过PPARδ/CPT-1通路改善骨骼肌异位脂质沉积和肌萎缩1.在高脂诱导的肥胖性肌肉衰减症模型和PA诱导的肌细胞萎缩模型中,RSV干预可以抑制PPARδ和CPT-1蛋白水平的下降。PPARδsiRNA转染肌管细胞后,RSV增加CPT-1蛋白水平的作用被削弱,说明RSV能激活骨骼肌中PPARδ/CPT-1信号通路。2.RSV干预可抑制高脂喂养的老年大鼠骨骼肌和PA处理的肌管细胞中TG水平的上升。而用PPARδsiRNA和CPT-1 siRNA转染肌管细胞后,RSV减少TG水平的作用被阻断,同时RSV和PPARδ激动剂抑制PA诱导的MHC蛋白水平和肌管直径下降的作用被削弱,提示RSV可通过PPARδ/CPT-1信号通路改善骨骼肌脂质沉积和肌萎缩。综上所述,我们的研究证实了线粒体功能紊乱、氧化应激和骨骼肌异位脂质沉积在肥胖性肌肉衰减症的发生发展中起重要作用。RSV可通过PKA/LKB1/AMPK通路减轻骨骼肌线粒体功能紊乱和氧化应激,以及通过PPARδ/CPT-1通路抑制骨骼肌异位脂质沉积,进而改善高脂诱导的肥胖性肌肉衰减症。这些发现对阐明肥胖性肌肉衰减症的病理生理机制具有重要的理论意义,也为RSV对肥胖性肌肉衰减症的潜在防治作用提供了依据。