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帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是常见的神经退行性疾病,在我国,65岁以上人群PD的患病率大约为1.7%。PD临床症状主要是运动障碍、记忆力减退、伴有便秘、睡眠障碍等,主要的病理特征是黑质(substantia nigra,SN)多巴胺能神经元的丢失,残存的神经元内观察到α-突触核蛋白的聚集和路易小体的形成。研究证实,炎症、氧化应激、铁沉积、蛋白质的异常聚集、线粒体功能障碍等均参与多巴胺能神经元的变性死亡过程。PD是一种多因素共同参与形成的疾病,其确切病因至今未明,但可以确定的是年龄因素、环境因素与遗传因素均可参与PD发病。在所有与PD相关的遗传因素中,GBA编码溶酶体酶葡萄糖脑苷脂酶(glucocerebrosidase,GCase)基因突变可导致戈谢病(Gaucher Disease,GD)的发生。GD患者和携带者患PD的风险增加,无论是否携带GBA突变,PD患者SN区GCase酶表达和活性均明显降低,提示了GCase异常和PD发病之间可能存在关联。有研究表明,GCase酶活性降低可导致葡萄糖神经酰胺(glucosylceramide,GlcCer)在溶酶体内累积,造成溶酶体功能障碍,抑制α-突触核蛋白的降解从而造成α-突触核蛋白的聚集—PD最重要的神经病理学改变。GlcCer可稳定低聚物形式的α-突触核蛋白聚集,α-突触核蛋白可部分阻止新合成GCase从内质网(endoplamic reticulum,ER)到高尔基体的运输,导致新合成的GCase不能进入溶酶体发挥作用,α-突触核蛋白与GCase之间形成恶性循环,最终可造成多巴胺能神经元的死亡。铁的异常聚积是PD的另一项重要的神经病理学改变。铁可通过Fenton反应产生羟自由基,引发线粒体功能障碍、氧化应激以及铁死亡等,造成多巴胺能神经元的退变死亡。本实验室前期在葡聚糖铁制备的大鼠模型和铁超载的细胞模型中证实铁可通过诱导氧化应激引起α-突触核蛋白表达升高且异常聚集,并且该作用可被抗氧化剂部分阻断。已有研究报道利用siRNA干扰SH-SY5Y细胞内PINK1的表达,由此诱导的线粒体功能障碍和氧化应激可造成GCase酶活性和蛋白表达的降低。在GCase抑制剂,环己烯四醇环氧化物(Conduritol B Epoxide,CBE)处理的J774巨噬细胞系中,GCase酶的活性降低,同时存在着铁转出蛋白(ferroportin1,FPN1)降低和细胞内铁的沉积。以上证据提示GCase表达或活性和铁代谢之间可能相互影响,但PD铁代谢异常对GCase表达或活性的影响尚未有研究报道。本实验在体外培养的SH-SY5Y细胞中,应用免疫印迹法、荧光酶测定法分别检测了柠檬酸铁铵(Ferric ammonium citrate,FAC)、CBE及二者协同作用对处理后GCase蛋白表达和GCase酶活性变化,检测了自噬受体蛋白(p62/SQSTM1)、自噬标志物(LC3II)等自噬功能的变化,检测了溶酶体标记物溶酶体相关膜蛋白-1(Lysosomal-associated membrane proteins-1,LAMP-1)和GCase转运蛋白溶酶体整合膜蛋白2(Lysosomal integral membrane protein-2,LIMP-2)的变化,检测了α-突触核蛋白的表达变化。在腹腔注射葡聚糖铁制备的大鼠模型中,应用免疫印迹法检测嗅球(olfactory blub,OB)、纹状体(Striatum,Str)区GCase蛋白、LIMP-2蛋白、α-突触核蛋白的表达变化;在Str区注射腺相关病毒-shRNA(Gba)(adeno-associated virus-shRNA(Gba),AAV-shRNA(Gba))干扰GCase蛋白表达后再观察铁超载后上述指标的变化。研究结果如下:1.100μmol/L FAC处理SH-SY5Y细胞4 h、12 h、24 h、48 h,GCase蛋白表达水平于4 h开始增加,4 h、12 h、24 h后GCase蛋白表达水平分别增加1.13倍、1.18倍和1.32倍,与对照组相比,差别有统计学意义(F=11.470,P<0.05,P<0.01,P<0.01)。48 h蛋白水平恢复至正常水平。100μmol/L FAC、100μmol/L CBE或100μmol/L FAC+CBE分别处理SH-SY5Y细胞24 h后,析因设计的方差分析显示FAC、CBE两种因素对影响GCase蛋白表达及酶活性不存在交互作用,因此分析FAC、CBE主效应的结果。FAC、CBE处理组GCase蛋白表达分别增加64%、73%,与对照组相比,差异有统计学意义(F=4.475,F=12.270;P<0.05,P<0.01);GCase活性分别降低38%、61%,与对照组相比,差异有统计学意义(F=4.776,F=20.021;P<0.05,P<0.01)。结果表明,细胞内铁超载能够诱导GCase蛋白表达上调和GCase酶活性降低。2.100μmol/L FAC、100μmol/L CBE或100μmol/L FAC+CBE分别处理SH-SY5Y细胞24 h后,析因设计的方差分析显示FAC、CBE两种因素对影响p62、LC3II蛋白表达不存在交互作用,因此分析FAC、CBE主效应的结果。FAC、CBE处理组p62蛋白表达分别升高48%、36%,与对照组相比,差异具有统计学意义(F=10.215,F=5.001;P<0.01,P<0.05);LC3II蛋白表达分别升高54%、50%,与对照组相比,差异具有统计学意义(F=6.026,F=4.392;P<0.05,P<0.05)。结果表明,细胞内铁超载或GCase活性抑制均能够诱导自噬受体蛋白p62、自噬标志物LC3II蛋白表达升高。3.100μmol/L FAC处理SH-SY5Y细胞24 h后,LAMP-1蛋白表达降低30%,与对照组相比,差异具有统计学意义(t=3.272,P<0.01);LIMP-2蛋白表达升高92%,与对照组相比差异具有统计学意义(t=3.737,P<0.001)。结果表明,细胞内铁超载可诱导SH-SY5Y细胞内溶酶体标记物LAMP-1蛋白表达下降,GCase转运蛋白LIMP-2表达升高。4.100μmol/L FAC、100μmol/L CBE或100μmol/L FAC+CBE分别处理SH-SY5Y细胞24 h后,析因设计的方差分析显示FAC、CBE两种因素对影响α-突触核蛋白表达不存在交互作用,因此分析FAC、CBE主效应的结果。FAC、CBE处理组α-突触核蛋白表达分别升高90%、87%,与对照组相比,差异具有统计学意义(F=5.915,F=4.901;P<0.05,P<0.05)。结果表明,细胞内铁超载或GCase活性抑制均能诱导α-突触核蛋白表达升高。5.葡聚糖铁腹腔注射大鼠1 w和2 w时,OB区GCase蛋白表达分别降低35%和21%,与生理盐水(normal saline,NS)对照组相比,差别有统计学意义(t=2.119,t=2.969;P<0.05,P<0.05);注射3 w和4 w时,OB区GCase蛋白表达与NS对照组相比差异无统计学意义;注射1 w时,Str区GCase蛋白表达与NS对照组相比差异无统计学意义,注射2 w、3 w或4 w时GCase蛋白表达分别降低41%、29%和43%,与NS对照组相比,差别有统计学意义(t=2.342,t=2.835,t=3.513;P<0.01,P<0.05,P<0.01)。结果表明,腹腔注射葡聚糖铁可降低OB区和Str区GCase蛋白的表达。6.葡聚糖铁腹腔注射大鼠1 w、2 w、3 w和4 w时,OB区LIMP-2蛋白表达与NS对照组相比差异均无统计学意义;注射在1 w、2 w和3 w时,Str区LIMP-2蛋白表达分别降低54%、42%和34%,与NS对照组相比,差别有统计学意义(t=3.618,t=3.529,t=2.942;P<0.05,P<0.05,P<0.05);在4 w时LIMP-2蛋白表达与NS对照组相比差异无统计学意义。结果表明,腹腔注射葡聚糖铁可降低Str区LIMP-2蛋白的表达。7.葡聚糖铁腹腔注射大鼠4 w时,OB区α-突触核蛋白表达升高69%,与NS对照组相比,差别有统计学意义(t=3.070,P<0.01);注射1 w、2 w和3 w时,α-突触核蛋白表达与NS对照组相比差异无统计学意义;注射3 w和4 w时,Str区α-突触核蛋白表达升高36%和45%,与NS对照组相比,差别有统计学意义(t=2.425,t=3.473;P<0.05,P<0.01);注射1 w或2 w时,α-突触核蛋白表达与NS对照组相比差异无统计学意义。结果表明,腹腔注射葡聚糖铁可升高OB区和Str区α-突触核蛋白的表达。8.AAV-shRNA(Gba)或AAV-shRNA(NC)病毒注射至大鼠Str区2 w后葡聚糖铁腹腔注射大鼠4 w,析因设计的方差分析显示铁、AAV-shRNA(Gba)两种因素对影响GCase蛋白表达不存在交互作用,因此分析铁、AAV-shRNA(Gba)主效应的结果。铁+AAV-sh RNA(NC)组、NS+AAV-shRNA(Gba)组,Str区GCase蛋白表达分别降低38%、34%,与NS+AAV-shRNA(NC)组相比,差别有统计学意义(F=14.715,F=12.064;P<0.05,P<0.05)。结果表明,腹腔注射葡聚糖铁或AAV-shRNA(Gba)均可降低Str区GCase蛋白的表达。9.AAV-shRNA(Gba)或AAV-shRNA(NC)病毒注射至大鼠Str区2 w后葡聚糖铁腹腔注射大鼠4 w,析因设计的方差分析显示铁、AAV-shRNA(Gba)两种因素对影响LIMP-2蛋白表达不存在交互作用,因此分析铁、AAV-shRNA(Gba)主效应的结果。铁+AAV-shRNA(NC)组与NS+AAV-shRNA(NC)组相比,LIMP-2蛋白表达差异无统计学意义;NS+AAV-shRNA(Gba)组,LIMP-2蛋白表达升高1.2倍,与NS+AAV-shRNA(NC)组相比,差别有统计学意义(F=32.574,P<0.01);结果表明,AAV-shRNA(Gba)可升高Str区LIMP-2蛋白的表达。10.AAV-shRNA(Gba)或AAV-shRNA(NC)病毒注射至大鼠Str区2 w后葡聚糖铁腹腔注射大鼠4 w,析因设计的方差分析显示铁、AAV-shRNA(Gba)两种因素对影响α-突触核蛋白表达存在交互作用,进行简单效应分析。铁+AAV-shRNA(NC)组、NS+AAV-shRNA(Gba)组或铁+AAV-shRNA(Gba)组,α-突触核蛋白表达分别升高88%、1.5倍和1.8倍,与NS+AAV-shRNA(NC)组相比,差别有统计学意义(F=5.404,F=66.455,F=10.767;P<0.05,P<0.001,P<0.001);铁+AAV-shRNA(Gba)与铁+AAV-shRNA(NC)组相比,α-突触核蛋白表达升高48%,差别有统计学意义(F=9.675,P<0.05)。结果表明,腹腔注射葡聚糖铁和AAV-shRNA(Gba)均可升高Str区α-突触核蛋白的表达,且二者之间存在协同作用。以上结果表明,铁超载后SH-SY5Y细胞内GCase酶的活性降低,GCase蛋白表达增加,自噬受体蛋白p62、自噬标志物LC3II的表达升高,α-突触核蛋白表达上调,与CBE处理结果一致。结果提示铁超载或GCase活性下降后细胞内自噬通量受损,导致自噬功能异常,可能与α-突触核蛋白表达上调有关。铁可降低溶酶体标志物LAMP-1表达而升高LIMP-2表达,提示铁可通过影响细胞内溶酶体的功能从而造成GCase酶活性的降低,后者可代偿性引起GCase与LIMP-2蛋白的增加。葡聚糖铁腹腔注射大鼠OB区和Str区GCase、LIMP-2表达下降,α-突触核蛋白表达升高。利用AAV-shRNA(Gba)使Str区GCase表达下降后,能够与铁协同导致α-突触核蛋白表达的升高。本实验探究了铁超载在体与离体对GCase表达及活性的影响,并为PD中铁代谢异常与GCase协同作用影响PD发病过程提供了新的实验依据。