肿瘤微环境（tumor microenvironment,TME）对结直肠癌（colorectal cancer,CRC）的发生和发展起着至关重要的作用。近年来,较多证据表明TME组分可用于指示结直肠癌患者预后,但都是基于大块肿瘤组织的混合测序,尚未有研究从单纯的TME组分出发对结直肠癌进行解析。在本次研究中为了探讨TME在结直肠癌分型中的作用,我们利用激光捕获显微切割（laser capture microdissection,LCM）获取结直肠癌其TME组分和上皮实质进行芯片表达谱测序。我们整合分析了一个包含结直肠癌上皮实质、TME、癌旁实质和癌旁微环境四个组分的表达谱数据后应用加权基因共表达网络分析（weighted gene co-expression network analysis,WGCNA）确定了四个组分的代表性模块并利用最近邻模块预测（nearest template prediction,NTP）将结直肠癌划分为三种免疫亚型,分别是“免疫激活型”（active immune,A.I.）、“基质激活型”（active stroma,A.S.）以及“混合型”（mixed type,M.T.）。这三种免疫亚型其免疫细胞浸润模式、免疫检查点抑制剂的表达情况、突变图谱、肿瘤突变负荷（tumor mutation burden,TMB）、拷贝数负荷、预后和化疗敏感性等方面存在差异。进一步分析表明,NF-kB信号通路激活是导致“基质激活型”患者无免疫细胞浸润的主要机制,提示NF-kB信号通路抑制剂是治疗“基质激活型”亚型的重要候选药物。单细胞测序新技术的出现使得在单个细胞层面上理解肿瘤成为可能,近年来多个癌种如肺癌、鼻咽癌、胃癌、结直肠癌等的TME图谱已被刻画。然而肿瘤细胞功能多样性及其与TME细胞是否协同作用以促进肿瘤侵袭和转移和背后的机制尚未可知。在本部分研究中,我们分析了两个结直肠癌单细胞数据集共包含29个肿瘤组织、6个肿瘤边界以及16个癌旁组织的单细胞转录组表达谱数据,发现癌旁和肿瘤组织具有不同的细胞组成,肿瘤表现出免疫抑制表型。对于实质细胞,我们总共解析出7个亚群并发现有一个具有高度侵袭能力的亚群C4。对C4代表性基因:LAMB3和ERO1A进行体外免疫组织化学染色（immunohistochemistry,IHC）,结果表明这两个基因与结直肠癌的不良预后相关。C4亚群的出现与肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophage,TAM）和癌症相关成纤维细胞（cancer-associated fibroblast,CAF）在 TME 的浸润水平密切相关。我们利用 多重免疫组化染色（multiplex IHC,mIHC）证实TAM和CAF不同亚群的存在并验证TAM与C4的相关性。总之,我们的研究阐述了结直肠癌的上皮细胞和TME细胞的异质性,发现肿瘤细胞、TAM与CAF存在协调促进作用,提示在CRC治疗上开发药物靶点时可关注在此作用网络。免疫细胞的空间分布对肿瘤的进展具有至关重要的作用。在结直肠癌中,尽管多种免疫细胞浸润水平与预后的关联已经被广泛证实,但这些研究忽略了免疫细胞的空间定位关系。在本部分研究中,我们利用多重免疫组化技术分析了3个分子panel共包含12个免疫分子、1个细胞增殖相关分子KI67以及辅助上皮细胞定位的分子PANCK。共得到14种表型各异的细胞,涉及T细胞、B细胞、髓系细胞谱系以及间质成分,用于探索结直肠癌中免疫细胞的空间分布情况。我们发现免疫细胞具有不同空间分布倾向,如免疫检查点IDO1+巨噬细胞主要分布在肿瘤组织内,而M1、M2类巨噬细胞则更在间质中的浸润密度更高。且微环境中的髓系细胞与肿瘤细胞的距离短于T细胞以及B细胞,提示各类免疫细胞在免疫防御、免疫逃逸的作用方式差别。肿瘤上皮30 μm的有效范围内CD8T细胞数目与OS相关,超过30 μm范围外则不显著;此外,我们对结直肠癌进行免疫细胞聚类,发现有一类亚群富集到B细胞、IDO1+巨噬细胞以及T细胞,其预后最佳。提示B细胞产生的体液免疫在结直肠癌免疫防御过程的重要作用。总之,我们在大样本范围内绘制了免疫细胞与肿瘤细胞的空间分布图谱并且在空间维度上证明髓系细胞是与肿瘤上皮联系最紧密的细胞。