【摘 要】
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本课题组已经在大肠杆菌中异源表达多聚磷酸盐依赖型激酶（PPGMK）,以多聚磷酸盐（六偏磷酸钠）代替价格高昂的ATP,低价地并且高效地合成6-磷酸甘露糖（M6P）。但PPGMK的热稳定性和酶活都较差,拟对酶进行定向进化。本研究合成了L7基因并构建p ET28a（+）-L7异源表达载体,结合易错PCR（EP-PCR）和定点饱和突变的方法对酶进行了改造,从随机突变文库中筛选出两个突变体LM4（H92L;
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本课题组已经在大肠杆菌中异源表达多聚磷酸盐依赖型激酶（PPGMK）,以多聚磷酸盐（六偏磷酸钠）代替价格高昂的ATP,低价地并且高效地合成6-磷酸甘露糖（M6P）。但PPGMK的热稳定性和酶活都较差,拟对酶进行定向进化。本研究合成了L7基因并构建p ET28a（+）-L7异源表达载体,结合易错PCR（EP-PCR）和定点饱和突变的方法对酶进行了改造,从随机突变文库中筛选出两个突变体LM4（H92L;A138V）、LM5（E119V）,评估了每个位点对热稳定性的影响,并以这三个突变位点作为热点,对每个位点进行了定点饱和突变。探究了每个位点的最适氨基酸并进行组合,每个位点的最适氨基酸分别为:H92K、E119R和A138R,最终确定了突变体LM6（H92K;E119R）为最优突变体。LM6使酶的热稳定性提升了5.4倍,50℃的半衰期达到了243 min,酶活提升为原来的2倍,Km降低说明了PPGMK对甘露糖的亲和力有所提升。经过100 ns的分子动力学模拟结果分析,原因是Lys-92能够与Gln-87形成氢键相互作用,氢键距离缩短,且Gln-87的羰基氧与Lys-92的氮原子形成盐桥;Arg-119的胍基能够与Glu-258的羧基形成盐桥,且这个盐桥可以牢牢固定α-螺旋与β-折叠。LM6在360K高温下的平均RMSD也远远小于WT,这也说明了LM6热稳定性的提升。PPGMK热稳定性的提升极大地便利了PPGMK在工业实际生产上的应用,不但降低了成本,也提升了生产效率。
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