生物催化转化过程主要依靠酶催化反应来实现反应的高选择性和高能效。酶的催化特性可以通过温和地调控其所处环境，实现对其催化活性、稳定性及催化效率的显著改变。借助基因工程手段可以存很大程度上改变酶的结构、催化性质等;并可在各类元件的介导下构建自组装体系、组织成多酶复合体，改善多酶催化过程的协同性并提高催化效率;另外借助酶在特定介质（如新型纳米材料）上的固定化，在实现对酶性质的改变和稳定性改善的同时，可有效地实现多酶反应体系在空间上的自组装。虽然传统的酶固定化方法如化学交联固定、包埋、微胶囊固定化等也可以实现多酶供固定化，但通常制备过程繁琐、反应条件激烈且具有一定的扩散限制。物理性吸附法虽然简单，但酶与介质之间的结合力较弱，外界环境因素的改变容易导致固定酶脱落、失活等。而通过基因工程手段，将介导元件与目的酶融合表达，从而利用介导元件与介质的特异性亲和作用将酶固定于载体可以有效的防止酶的丢失且酶的固定化步骤简便。　　纤维素结合域(Cellulose Binding Domain，CBD)具有与纤维素识别和结合的独特生物学功能，能在较宽泛的条件下与不同的纤维素紧密结合。利用CBD将酶固定到纤维素材料，驱动酶分子与纤维素材料自组装，以期实现缩短底物通道和高效调控蛋白分子空间取向的目的。本课题通过基因工程原理，将纤维素结合域与目的酶融合表达并引导目标酶与纤维素材料的自组装，从而为底物的高密度捕集及生物催化转化提供高性能催化体系，并以此开发高效的酶基生物传感器。课题结合基因工程、纳米技术、酶工程、电化学和传感器多学科技术，开展基于新型纳米固定化材料制备高活性和高稳定性的固定化酶催化剂的研究，创建自组装纸质乳酸传感器的新方法，实现对底物流通衔接渠道、辅酶循环渠道以及反应动力学限制步骤的优化，获得多酶基础催化性能优化和高效利用的多功能智能型催化体系及乳酸传感器。项目研究特色明显、意义重大，所获得的主要研究成果如下:　　(1)包含辅酶的多酶催化剂的纳米尺度组装和功能优化。通过构建多酶复合体结构，可以优化底物渠道，有效提高反应效率，考虑到纳米材料的分子空间特质和底物产地动力学的优化设计机制，我们构建了基于CBD结合的多酶催化的纳米组装体系。将辅酶依赖酶乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)和NADH氧化酶(NADH oxidase，NOX444)通过融和表达CBD标签固定于纳米纤维素材料上，构建高效的辅酶共生反应体系。该体系中，LDH利用辅酶NAD+催化乳酸产生丙酮酸和NADH，同时NADH作为NOX444底物又被氧化为NAD+，实现辅酶再生。利用纳米纤维素固定化的CBD融合酶酶活高于其游离形式的比酶活，Km值降低;相比于游离酶，固定化酶在4℃和室温的稳定性得到显著提高，通过CBD直接吸附获得的固定化LDH-CBD在4℃储存34天仍保留95％酶活。通过研究不同的LDH/NOX444比例及辅酶NAD+对反应体系产率的影响等因素确定了多酶反应体系的最佳反应条件，纳米纤维素固定化多酶反应体系的催化产率是单一酶反应体系产率的2.3倍。由此通过多酶纳米尺度组装提升了辅酶共生催化体系的时空产率强度并为纳米尺度多酶催化提供了充足的理论和技术支持。　　(2)基于CBD结合的自组装纸质乳酸传感器。通过CBD标签与纸质纤维素之间的特异性相互作用进行自组装，得到基于乳酸脱氢酶(LDH)的乳酸纸质传感器。滤纸对LDH-CBD的最大吸附量可达到21.7 mg LDH-CBD/g滤纸。将LDH催化的反应与显色反应偶联，利用比色分析手段对乳酸浓度进行检测，有效检测乳酸浓度线性范围为0.5-8 mM。固定于滤纸上的LDH-CBD具有较高的稳定性，在4℃或者室温下可以保存两周;固定化酶活半衰期达到21天，是LDH半衰期的25倍，是游离LDH-CBD的84倍。这种基于CBD融合蛋白与纸质之间特异性吸附的手段可以一步化制得高效、灵敏、稳定的酶基纸质传感器。为研发制备高效自组装纸质传感器提供了新的思路。　　(3)基于LDH-CBD的纳米尺度组装体系，开发不同检测方法的乳酸传感器。为了允分利用CBD介导的多酶催化剂纳米组装体的高稳定性、高催化效率的特点，我们构建了由催化产生过氧化氢(H2O2)的NOX1-CBD和LDH-CBD耦合的多酶纳米组装反应体系。通过检测H2O2浓度来间接检测乳酸的浓度。通过此方法提高了乳酸检测的灵敏度，检测线性范围在0.01-0.05 mM的乳酸浓度，通过样品处理，可满足人体乳酸浓度(0.5-12 mM)的检测。另外，我们还探索了利用电化学方法直接检测LDH-CBD催化产物NADH的可行性，利用碳纳米管修饰的电极，通过优化反应条件，降低了反应液中Mn2+的干扰信号并得到了NADH在反应液中的标准曲线，为进一步设计基于LDH-CBD固定化酶的传感器提供了检测方法。