新型生物传感器及其在相关生物物理研究中的应用

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低温生物学和细胞力学是现代生物医学工程领域中的两个重要分支。本博士论文以冷冻保存血小板为主线,阐述了作者为解决血小板冷冻保存这一世界性难题,在上述两个领域中所做的研究工作。本文第一部分主要针对血小板冷冻保存环节中所面临的如何更快速精确的测量生物材料导热系数、如何更深入的认识低温冷冻期间水的跨膜传输特性和如何更准确的预测胞内冰形成概率这三个问题。笔者详细介绍了一种基于微纳米加工技术,可以对生物材料的微观热物性进行高精度自动化测量的微电子机械系统的研发工作;同时,还详细阐述了使用该套系统在探索生物材料微尺度传热以及细胞冷冻损伤过程中所进行的基础性研究。笔者通过微纳米加工技术将传统的热物性探针微型化,并将热探针的制造工艺工业化,将热探针的精度校准和测量过程自动化和标准化。笔者成功的在4英寸硅晶圆上将作为微探针能量发生单元和导热系数测量单元的尺寸进一步降低成线宽仅为3微米、线间距仅为5微米的蛇形高密度金属热丝。同时,微探针的分割切片技术也升级成为自由度及加工精度都更高的感应耦合等离子体深硅刻蚀技术,能够更快更容易的制造出尺寸和形状都更为多样的微型热物性探针(单针局部测量或阵列式多针多点测量)。通过对不同低温保护剂和不同生物材料在不同温度下进行大量且系统的导热系数测量,笔者发现使用微纳米加工工艺制造出的微型探针拥有更小的热容,更紧凑的探针阵列,能更直接地与被测样品接触,通过使用不同结构的热探针可以更准确、更灵敏、更可靠的对生物及其相关材料进行单点微创式热传导系数的测量,或者获得某个特定区域内的热物性分布数据。整套芯片的制备过程已经完成了从微纳米加工与传统精密制造工艺的混合制造到纯微纳米加工的转型,能够像生产集成电路一样,实现高良品率、高物理和电学相似性的大批量生产,完美解决了传统热传导系数测量设备与方法在临床应用和科学研究上的缺陷与不足(只能对材料进行离体检测,设备内部结构复杂,繁琐的测量前准备工作,灵敏度低,制造难度大等)。与此同时,我们的实验结果还揭示出一直被广泛采用的热探针精度标定过程存在严重缺陷,当测量温度和标定温度不一致时,通过常规标定过程所得出的热探针系统精度校准常数会导致最终测量结果出现较大误差。因此,我们提出了一套新的标定与测量流程,有效确保了热探针系统精度校准常数的准确性,使得最终测量结果的分析与处理过程标准化、统一化、精准化。并且根据所获得的实验数据,通过使用联合拟合、方程组合等数据分析方法,笔者还首次提出了一种基于Second-order Polynomial和Filippov equation的可用于预测不同浓度的二元低温保护剂溶液在不同温度下导热系数的双因素(温度和浓度)理论公式。通过使用研发出来的微纳米热探针和低温显微镜平台,笔者还对细胞的跨膜水传输特性和胞内冰形成概率进行了深入的学习。由于实验条件的限制,笔者使用了人子宫颈癌细胞作为概念证明实验里的实验对象。对人子宫颈癌细胞在不同降温速率下体积的变化情况进行了仔细深入的观察与分析,对人子宫颈癌细胞的冷冻响应特性(跨膜水传输性质和胞内冰形成概率)进行了系统的研究。使用Mazur提出的跨膜水传输模型,联合拟合得出人子宫颈癌细胞细胞膜的水传输参数,从而进一步预测在其他冷冻环境下细胞跨膜水传输的响应规律。笔者在实验中发现胞内冰的形成主要分为Darkening和Twitching两种类型。这两种不同类型的胞内冰形成机制很可能与最初所形成的胞内冰大小密切相关。通过使用Toner提出的胞内冰生成概率模型对实验结果进行拟合,笔者还发现该模型存在较为严重的弊端和局限性,因此笔者通过引入临界体积这一新参数,提出了一种新的能更准确预测胞内冰生成概率的改进型理论模型。利用微纳米加工技术大规模生产微尺度热探针是现代科学技术与传统生物热物理测量技术的完美结合。在传统宏观生物材料热传导系数测量技术的基础上,从微尺度、微创和集成的角度上,更加准确、可靠和全面地研究生物活体材料及其相关材料的微尺度传热及损伤特性,这不仅可以帮助认识和发现生物材料在微观传热过程中的本质规律,还可以在生物材料或器官的低温冷冻保存、低温或聚能外科手术及相关传热领域中,提供必要的研究测量技术和理论依据。本文的第二部分主要针对冷冻血小板复温后所面临的如何快速可靠的对血小板功能进行定量测量的问题。笔者详细阐述了一种基于BioMEMS技术对对血小板收缩力进行定量检测的细胞微力测量系统的研发和使用该系统对血小板综合性功能进行评估的探索过程。激活后的血小板,其中后期的功能表达主要表现在用产生的血小板收缩力来强化和巩固前期形成的松散的止血拴,让止血栓能更牢固地粘附在受损血管的裂口处,继续起到止血,维护血管壁完整性的作用。在本文中,我们提出用血小板收缩力来做为检验其中后期功能的新指标,并详细阐述了一种通过利用阵列微柱式微力感测系统对血小板收缩力直接进行微力测量的技术。笔者通过微纳米加工技术制造出具有不同直径(600纳米-3微米)、不同高度(5-15微米)和不同微柱间距(1-3微米)的微柱阵列,而且用该微力感测系统首次测量并研究了处于纳牛顿量级上半静态下的血小板收缩力与外界生物蛋白、刺激剂和刺激时间等参数之间的关系,更首次在高倍微显条件下动态观测并分析了血小板收缩力的整个产生、发展和变化过程。通过阵列微柱式微力感测系统,血小板收缩力首次被高精度的测量出来,由此,为解决血小板功能性检测这一世界性难题,提供了新的解决思路和办法。为早期发现血小板功能异常,指导血小板抗凝药物开发和阐明相关疾病的形成机理,提供了必要的技术设备和奠定了一定的理论基础。总的说来,本论文针对血小板在低温保存和复温后功能检测这两个方面进行了系统深入的研究。成功研发出的两种新型微纳米生物传感器,可以很好的用于检测生物材料的热物理和力学特性。在其他相关生物医学领域的研究中,我们提出的新的微纳米生物医学微全分析系统系统与检测方法也有着广泛的应用前景。
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