嗜热蛋白酶WF146是嗜热菌Bacillus spWF146分泌的一种丝氨酸蛋白酶,属于枯草杆菌蛋白酶家族（Subtilisin family）。该酶以前体形式合成,包含信号肽、N端前肽和成熟酶三个部分,其中成熟酶部分含有一对二硫键（Cys52-Cys65）。蛋白酶WF146经过60℃保温处理后能自加工成熟,转变为32 kDa的成熟酶形式。该酶最适反应温度为85℃,最适pH为8.0左右,在10 mMCaCl2和10mMNaCl存在时60℃保温2h以上酶活力保持不变。在还原条件下或酶浓度较高时（大于5μg/ml）该酶会发生自降解,产生分子量分别为25kDa和7 kDa的两条降解带。蛋白酶WF146产生自降解的机制和抗自降解研究是本研究的重点。此外,我们还对该酶的抗自降解突变体N63P/A66P在处理角蛋白废弃物及朊蛋白污染方面的应用开展研究。首先,我们通过分子筛对自降解产物进行分离,并通过N末端测序确定了自降解的两个切点,分别为Asn63-Gly64和Cys65-Ala66。活性染色和酶活性测定结果发现自降解产物仍然保留催化能力。戊二醛交联和共复性实验表明自降解产生的N端肽段（FN）和C端肽段（FC）并未分离,是以复合体的形式存在的,从而保证了酶分子催化中心的完整性。虽然自降解复合物的活性与完整成熟酶相比没有显著变化,但是其稳定性有较大下降,这也正是自降解会导致酶整体稳定性下降的主要原因。从同源模拟的三维结构上看,两个自降解位点均位于一个分子表面的环结构中。为了删除自降解位点,我们分别或同时在Asn63和Ala66引入刚性最强的氨基酸残基Pro。结果显示,突变体N63P、A66P和N63P/A66P在80℃的稳定性相比野生型酶都在不同程度上有所提高,其中双突N63P/66P不仅在还原条件下和非还原条件下的半衰期分别提高到野生型酶的2.8倍和2.2倍,而且在高温下（80℃）对可溶性底物（casein）及不可溶性底物（keratin azure）的降解能力也都有提高。这些结果表明,酶分子表面环局部结构的柔性较强是导致自降解发生的主要原因,增强局部结构的刚性可以减少甚至避免自降解的发生。角蛋白是一种广泛存在于动物毛发及表皮中的结构蛋白,富含大量二硫键和p-折叠结构,这些结构使其成为最难降解的蛋白之一。实验表明在80℃及还原剂存在的条件下N63P/A66P能在3h左右明显将完整羽毛降解,而要达到相同的降解程度蛋白酶K在50℃需要24h。另外,N63P/A66P还能在高温下水解PrPSc-like淀粉样朊蛋白纤维。实验结果表明抗自降解突变体N63P/A66P在处理角蛋白废弃物和医疗器械中有良好的应用潜力。为了获得大量有活性的重组蛋白酶便于今后的工业应用,我们将蛋白酶WF146克隆到分泌性表达宿主枯草芽胞杆菌和巴斯德毕赤酵母中。结果表明蛋白酶WF146成功的分别在枯草芽胞杆菌和巴斯德毕赤酵母中表达并分泌到胞外,表达量分别达到5μg/ml和50μg/ml。酵母中表达的重组蛋白酶被N-糖基化修饰,使野生型蛋白酶WF146的抗自降解能力有所提高。