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研究背景:肛瘘是肛肠科常见疾病,其中高位肛瘘的手术创伤较大、愈合时间较长、肛门功能受到影响,严重甚至导致大便失禁。如何加速肛瘘患者术后创面愈合已成为肛瘘治疗的重要目标之一。古代文献中有芫花根治疗痔瘘疾病的记载,其中大部分与药线治疗痔瘘疾病相结合。肛瘘挂线与内痔系痔疗法(结扎疗法)中都使用了芫花根煮线的方法。对于为什么要使用芫花根而不采用其它药物煮线,以及采芫花根煮线后有什么功效等,其他现代研究文献尚未见到。有研究发现通过乙醇从芫花根中提取出的化学物质,可起到抗炎、减轻水肿及镇痛作用。近年研究表明:(1)TGF-β、MMP-3、Timp-1、COL1 Al、COL3A1、MEKl/2 和 ERK1/2是影响创面愈合的重要因素。(2)在创面修复过程中,HSF细胞作为肉芽组织的主要构成细胞,是促进创面愈合的关键。(3)MEK/ERK信号通路在细胞的生长和增殖起着重要的作用,MEK1/2,ERKl/2促是MEK/ERK信号通路的激活因子。本研究拟分临床用药观察、细胞模型和动物模型三个部分,采用实时定量PCR,Western Blot以及免疫组化等研究手段从整体、细胞及分子水平观察芫花根水提物对肛瘘的治疗作用,探讨其有效作用成分及可能的作用机制,为其应用于肛瘘的治疗提供相应理论依据。第一部分完花根水提物对肛瘘患者创面愈合及相关基因表达的影响目的:通过比较芫花根水提物治疗组与对照组患者创面愈合的时间长短,以及肉芽生长质量和速度等来判断芫花根水提物的疗效。方法:60例有手术指征的高位肛瘘患者入选临床实验,随机分成对照组和用药组,两组均进行挂线手术,用药组术后予以芫花根水提物浸膏涂抹创面,连续换药7天,对照组术后予以黄芩油膏创面换药。术后观察并比较两组患者创伤愈合情况;采集患者体表新生肉芽组织,采用实时定量PCR,Western Blot以及免疫组化等方法检测并比较两组肉芽组织中 COL1A1、COL3A1、Timp-1、MMP-3、MEK1/2 和 ERK1/2 的表达情况。结果:1.芫花根水提物处理组患者伤口愈合时间(23.1±2.8d)显着低于对照组的伤口愈合时间(28.7±3.4d)(P<0.05);2.芫花根水提物处理组患者肉芽组织中COL1A1、COL3A1、Timp-1、TGF-β、MEK1/2和ERKl/2的表达显着升高,而MMP-3的表达显着降低(P<0.05)。结论:芫花根水提物可有效缩短患者伤口愈合时间,促进肉芽组织生长。第二部分 芫花根水提物对瘢痕和受损人成纤维细胞的影响目的:用不同浓度的芫花根水提物处理人皮肤成纤维细胞系(HSF),观察芫花根水提物在HSF细胞增殖方面的作用,检测HSF细胞中相关基因的表达变化情况。方法:在体外实验中,利用TNF-α(10μg/ml)诱导构建受损的人皮肤成纤维细胞(Human skin fibroblasts,HSF)模型;予以适量浓度水提物培养处理细胞后,采用CCK-8法和流式细胞术观察分析芫花根水提物对受损HSF的细胞活力、细胞周期和细胞凋亡的影响;此外,利用实时定量PCR和Western Blot等方法检测受损HSF模型中TGF-β、COL1 Al、COL3A1、Timp-1、MMP-3和MEK/ERK等信号通路相关分子的表达情况。结果:1.芫花根水提物可促进HSF生长,而当浓度达到25μg/ml时作用最为显着;流式细胞术结果表明芫花根水提物可显着增加S期细胞比例,从对照组的20.99%增加至芫花处理组的27.71%,而G0/G1和G2/M期的细胞比例下降(P<0.05);2.在HSF细胞系中,芫花根水提物处理组的COL1A1、COL3A1、Timp-1、c-Fos和CyclinD1的表达显着高于空白对照组,而MMP-3的表达显着低于空白对照组(P<0.05)。3.在HSF损伤模型中,TNF-α诱导的细胞凋亡被芫花根水提物显着抑制(早期细胞凋亡比例从27.4%到19.4%,晚期细胞凋亡比例从 15.7%到 9.4%),TNF-α 诱导的 COL1A1、COL3A1、Timp-1、Cyclin D1和c-fos表达下调均被芫花根水提物明显反转(P<0.05)。结论:1.芫花根水提物可显着增加S期细胞比例,促进HSF生长;2.芫花根水提物可活化HSF细胞系中MEK/ERK信号通路,抑制细胞凋亡;第三部分芫花根水提物对创面感染大鼠创面修复的影响目的:观察芫花根水提物对人粪污染感染大鼠创面模型的创面愈合情况以及相关基因的表达情况。方法:采用人粪便分离的大肠杆菌悬液对大鼠创面进行喷洒的方法构建创伤大鼠模型,建模成功后,用药组予以芫花根水提物浸膏敷药、换药,对照组以无菌水代替;持续12d,观察对照组和芫花根水提物处理组大鼠创伤修复情况;采集创面组织样本,利用实时定量RCR和Western Blot检测TGF-β、MMP-3、Timp-1、COL1A1、COL3A1、MEK1/2和ERK1/2的表达变化情况。结果:1.芫花根水提物处理组第8天创面基本完成愈合或瘢痕化。COL1Al、COL3A1和Timp-1表达显着上调,而MMP-3表达显着下调;2.芫花根水提物上调大鼠创面组织中MEK1/2和ERK1/2的蛋白水平。结论:芫花根水提物有效促进大鼠创面愈合,其机制可能与上调TGF-β的表达以及激活MEK/ERK信号通路相关。