论文部分内容阅读
聚羟基脂肪酸酯PHA(Polyhydroxyalkanoate)是存在于多种微生物及其他生物体细胞内的一种聚酯内含物。由于具有生物降解性、生物相容性、高结晶特性等优点,PHA也是一种环境友好型热塑性塑料,甚至可以被自然界中的微生物完全降解。PHA的优良性能使其成为研究热点,然而目前对于PHA合成途径中关键酶的结构的认识尚不完全清楚。本研究以蓝藻集胞藻PCC6803全基因组DNA为模板,克隆编码PHA家族蛋白的pha A、phaB、phaC、和phaE基因并与载体pET28a和pColdⅡ相连接,构建其原核表达载体,再将测序正确的质粒转化到E.coli BL21(DE3)感受态细胞中。优化培养条件以提高PHA家族蛋白在大肠杆菌中可溶蛋白的表达量,经Ni柱亲和层析纯化获得蛋白,并初步探究了SpPhaB结晶条件。实验成功构建了pET28a-SpPhaA、pET28a-SpPhaB、pET28a-SpPhaC、pET28a-SpPhaE、pColdⅡ-SpPhaA和pColdⅡ-SpPhaC表达载体。优化获得SpPhaB可溶蛋白的最佳表达条件为:诱导温度37°C、转速220 r/min、IPTG浓度0.1 mmol/L、诱导时间7 h。SpPhaE的可溶性蛋白最佳表达条件为:诱导温度25°C、转速220 r/min、IPTG浓度0.5 mmol/L、诱导时间7 h。SpPhaB经由镍柱亲和层析和FPLC纯化后,每升菌体可获得5 mg SpPhaB蛋白,SpPhaB经由镍柱亲和层析和FPLC纯化后,每升菌体可获得2.925 mg SpPha E蛋白。使用Hampton公司的结晶试剂盒筛选蛋白结晶条件,同时优化蛋白浓度,沉降剂浓度,盐离子浓度,最终获得的SpPhaB最佳结晶条件为4°C、0.22 mol/L Magnesium acetate tetrahydrate、0.1 mol/L sodium cacodylate trihydrate、pH 6.5、18%PEG8000的结晶培养液,将1.5μL浓度为10 g/L的蛋白液与1.5μL的晶体培养液混合培养。实验结果为揭示PHA合成途径中关键酶的结构进而认识酶与底物结合机制等奠定了基础。