背景百草枯是时下世界上应用最多的除草剂,对人和动物均有较强毒性。百草枯中毒在临床中的死亡率极高,目前尚无明显有效的救治方法。百草枯中毒的病死率与口服百草枯的量有密切关系,一般认为口服20%百草枯水剂>20 mg/kg即可导致死亡。目前我国多采用液相-质谱联用法、紫外分光光度法、毛细血管电泳法、高效液相色谱法等进行检测,但这些检测方法均需要复杂的样品前处理,在前处理过程中会丢失部分百草枯,造成检验结果的不准确,且不同样品的百草枯残留有各自最佳的检测方法,不仅加大了检测难度还增加了检测费用,因此需要建立一种高效、可靠、简便的百草枯残留检测方法,指导临床治疗和判断预后。百草枯进入人体后通过炎症反应、氧化损伤等导致各个器官均受损害,其中严重肺纤维化所致的呼吸衰竭是百草枯中毒最主要的死亡原因,因此减缓肺纤维化的进程,降低死亡率,是百草枯中毒治疗的关键。目前临床上首选的治疗方法为血液净化,但血液净化费用昂贵,且研究发现血液净化虽然能够延长生存时间,但对降低病死率的作用不大。所以百草枯中毒的治疗方法一直是临床上的难题,建立规范、标准、有效的治疗方案是急需解决的问题。目的研制一种前处理简单、灵敏度高,且能同时检测食物、血液、尿液以及胃液中百草枯残留的间接竞争ELISA试剂盒,以满足农业及临床上的快速检测需求;验证百草枯模拟抗体对百草枯所致急性肺损伤的解毒效果,探讨临床应用的可行性。方法1.本实验利用抗原抗体特异性结合的原理,采用间接竞争ELISA方法来检测百草枯的残留。首先合成百草枯完全抗原(PQ-OVA)作为包被原,然后加入目标物与固定抗原共同竞争抗百草枯抗体,最后加入酶标二抗,显色并终止后读取OD450值,利用百草枯抗体与百草枯小分子的高度专一性来推算目标物中小分子的含量。本研究通过优化ELISA的各种相关条件提高检测灵敏度,具体优化内容包括:⑴包被原及抗百草枯抗体浓度。⑵包被时间,包被孵育温度。⑶选择封闭液的种类、浓度,封闭量和封闭时间。(4)一抗稀释液的筛选。(5)竞争时间。(6)二抗稀释液的选择。(7)酶标二抗的浓度及酶标二抗反应时间。(8)底物a与b的比例。(9)底物显色时间。(10)抗体稳定剂的选择。按照优化好的条件建立标准曲线,选择白菜、玉米、大豆、血液、尿液、胃液作为样品,确定试剂盒的加标回收率及变异系数,验证试剂盒的灵敏度、稳定性、特异性等。最后对抗体及试剂盒的有效期进行检测,确保满足试剂盒的应用要求。2.同时建立百草枯中毒大鼠模型,观察抗百草枯模拟抗体对百草枯所致的急性肺损伤的解毒作用。首先纯化抗百草枯模拟抗体,确保其能够特异性识别百草枯小分子。然后建立百草枯中毒大鼠模型,选取6~8周的spf级大鼠65只,体质量200~250g,随机分为3组,其中对照组15只,染毒组25只,治疗组25只,正常饲养条件。对照组腹腔注射无菌生理盐水(ns)1.8ml/kg;染毒组腹腔注射20%百草枯水剂18mg/kg,20%百草枯水剂用无菌生理盐水稀释至10mg/ml后再注射;治疗组(pq抗体组)在pq中毒2h后立即尾静脉注射抗pq模拟抗体(1mg/kg),连续注射等剂量抗体3天。连续14天观察各组大鼠的表现和反应,并分别于1、3、7、14天时处死3只大鼠,采血离心检测tgf-β1和il-6的表达水平,并取左下肺叶于10%甲醛液浸泡后石蜡包埋,做成4μm厚的切片,苏木精-伊红染色(h-e染色)后行显微镜观察病理变化,对比三组的不同点。结果1.间接竞争elisa最佳反应条件如下:包被抗原和一抗工作浓度分别为2.0μg/ml和1:28000;包被温度和时间为4℃14h;封闭液为1%ova;封闭量为150μl;封闭时间为45min;竞争结合反应时间为45min,二抗作用时间为30min,酶标二抗浓度为1:4000;显色液比例为a/b=1/19;显色时间10min。2.试剂盒的最低检测限即ic10为0.08ng/ml,线性检测范围为0.16~10.76ng/ml,ic50为1.32ng/ml。该试剂盒与敌草快的交叉反应率仅为0.01348%.各种样品添加回收率均高于80%,变异系数小于14%,板内变异系数在0.24%~9.57%之间,板间变异系数在1.17%~11.09%之间,结果表明该elisa法同国家标准检测方法相比,其检测灵敏度更高。3.百草枯模拟抗体成功表达,经间接竞争elisa验证,其具有良好的竞争活性。以18mg/kg的剂量成功建立了百草枯中毒模型,同时用百草枯模拟抗体解毒。中毒组显微镜观察显示,大鼠肺组织的损伤随着实验天数的增加而日益加重,成批的炎性细胞浸润,肺纤维化逐日形成。而治疗组肺组织炎症减轻,实验过程中未出现明显纤维化。中毒组tgf-β1和il-6水平随着试验时间的延长逐渐升高,而治疗组在注射百草枯模拟抗体后TGF-β1和IL-6水平呈下降趋势。结论1.研制的百草枯残留检测间接竞争ELISA试剂盒可同时对食物、血液、尿液以及胃液进行检测,灵敏度高、特异性佳,样品前处理简单,添加回收率高,变异率低,完全可满足检测需求。2.百草枯模拟抗体能抑制TGF-β1和IL-6的分泌,减轻百草枯中毒所致的肺损伤,并可在一定程度上阻止发展为肺纤维化。