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Apelin受体APJ和κ型阿片受体（kappa opioid receptor，KOR）都是G蛋白偶联受体（G protein-coupled receptor，GPCRs）超家族的成员。在中枢神经系统和心血管系统中参与多种生理功能的调控过程。到目前为止，关于两个受体异源二聚化的研究尚未见报道。本课题试图探讨APJ和KOR在细胞膜及细胞内信号转导过程中是否可以形成异源二聚体，研究异源二聚体的形成是否对细胞内信号转导途径有影响。为分析两种受体参与的相关生理功能及多种疾病的病理生理机制提供实验依据，为相关药物的开发提供新的治疗靶点。
本实验通过构建APJ与KOR的各种表达载体，然后瞬时或稳定转染人胚胎肾（human embryonic kidney，HEK293）细胞，建立单独或共表达APJ和KOR的细胞系。然后通过免疫共定位、免疫共沉淀及生物发光共振能量转移（bioluminescence resonanceenergy transfer，BRET）等多个实验环节，研究在APJ和KOR介导的信号转导过程中APJ与KOR之间是否能够形成异源二聚物。
本研究采用分子克隆方法构建了多种含人APJ和KOR全长cDNA的真核表达载体，在此基础上构建用于BRET的两个真核重组质粒：pRluc-hKOR-pcDNA3.1和pEGFP-hAPJ-pcDNA3.1。Western blot显示受体成功表达。激光共聚焦显微镜观察显示，受体在细胞膜表达，定位正确，可用于进一步的实验。
利用HA-APJ和Myc-KOR两个重组质粒单独或共同转染HEK293细胞，进行免疫荧光染色，激光共聚焦显微镜观察结果显示，两个受体均表达在细胞膜上，定位高度一致。
利用上述质粒转染后，提取蛋白进行免疫共沉淀实验，用抗HA抗体进行免疫沉淀，采用抗Myc抗体作为一抗进行Western blot检测，结果显示，只有在共转染HA-APJ和Myc-KOR的HEK293细胞沉淀样品中，检测到抗Myc抗体反应条带，且在50 kDa（相当于Myc-KOR）和100 kDa（相当于HA-APJ和Myc-KOR二聚物）处有两个主要的条带。提示HA-APJ和Myc-KOR在HEK293细胞中，以异源二聚物的形式结合。采用生物发光共振能量转移（BRET）技术，在活细胞中实时、动态的研究了二者之间的相互作用。实验利用前期构建的pRluc-hKOR-pcDNA3.1和pEGFP-hAPJ-pcDNA3.1（按不同的比例）共同转染HEK293细胞，转染后48 h，加入发光底物进行BRET信号检测。结果显示，在Rluc-KOR和EGFP-APJ共转染组的细胞，随着受体浓度的增加，BRET值逐渐增加，并且达到饱和，BRET50值为2.9，表明二者的结合为特异性结合。进一步证实APJ与KOR在HEK293细胞中能够发生特异性的相互结合。并且这种特异性的相互作用是组成性的（constitutive）。用APJ的配体apelin-13和/或KOR的配体强啡肽A（1-13）[（dynorphinA（1-13），DynA（1-13）]处理15min，用apelin-13或DynA（1-13）单独处理后，BRET信号明显增强。而应用apelin-13和DynA（1-13）联合处理，BRET信号又比apelin-13或DynA（1-13）单独处理更加明显。表明配体的刺激能够增强相互作用的亲和力。以上共定位、免疫共沉淀及BRET三个实验都证实，APJ和KOR之间能够相互作用，可靠地形成异源二聚物。
通过实验充分证实，APJ和KOR在HEK293细胞中发生异源二聚化结合，据此推测异源二聚物的结合可能会对受体介导的信号转导途径具有重要意义。本研究检测了与APJ和KOR信号转导有关的四种细胞内关键信号分子：细胞外信号调节激酶1和2（extracellular-regulated kinases1/2，ERK1/2）、环腺苷酸（cyclic AMP，cAMP）、血清反应元件（Serum response element，SRE）和cAMP反应元件（cAMP response element，CRE）。为了得到稳定的信号，本实验采用APJ和KOR稳定转染HEK293细胞（HEK293-APJ/KOR cells）的细胞系进行研究。
采用Western blot检测ERK1/2磷酸化，分别检测了时间依赖的和浓度依赖的ERK磷酸化。结果显示，与apelin-13处理的HEK293-APJ细胞或DynA（1-13）处理的HEK293-KOR细胞相比，HEK293-APJ/KOR细胞用apelin-13或DynA（1-13）刺激后，从5 min到60 min，ERK1/2磷酸化显著增加；而且，DynA（1-13）处理的HEK293-APJ/KOR细胞磷酸化峰值提前至5 min（其他组为15 min）。
浓度依赖的ERK磷酸化检测结果表明，在DynA（1-13）处理的HEK293-APJ/KOR细胞中，从10 nM-100 nM，ERK磷酸化的值显著高于apelin-13处理的HEK293-APJ细胞或DynA（1-13）处理的HEK293-KOR。有趣的是，在apelin-13处理的HEK293-APJ/KOR细胞，apelin-13在较低的剂量（0.01 nM）使ERK1/2的激活达到最大值，并且随着浓度的升高，磷酸化程度降低。从0.01 nM-1000 nM，ERK磷酸化的值显著高于HEK293-APJ或HEK293-KOR细胞。实验表明，在共表达的细胞中，ERK激活的敏感性显著增加。ERK磷酸化明显被蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）抑制剂BisⅡ阻断，提示在HEK293-APJ/KOR细胞中，ERK1/2磷酸化的增强依赖于PKC的激活。
放射免疫测定（Radioimmunoassay，RIA）检测cAMP含量的实验结果表明，HEK293-APJ/KOR细胞与HEK293-APJ细胞或HEK293-KOR细胞相比，用apelin-13或DynA（1-13）处理后，福司柯林（forskolin，FSK）诱导的cAMP水平显著降低。
研究表明，阿片和apelin激活ERK通过PKC通路，而cAMP依赖的蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）通路总是依赖于cAMP途径的激活，推测APJ和KOR能协同性地增强PKC通路而抑制PKA通路。实验采用双报告基因法检测了下游的SRE和CRE信号。在稳定转染的HEK293-APJ、HEK293-KOR和HEK293-APJ/KOR细胞中瞬时转染pSRE-luc或pCRE-luc，检测SRE和CRE的变化。结果表明，四组细胞中，SRE的活性均显著增强而CRE的活性均显著降低。HEK293-APJ/KOR与HEK293-APJ或HEK293-KOR细胞相比，SRE-luc活性显著增强而CRE-1uc活性显著降低。在所有处理的细胞中，PKC抑制剂BisⅡ完全阻断SRE-luc活性，表明在稳定转染的HEK293-APJ/KOR中，apelin-13或DynA（1-13）介导的SRE增强依赖于PKC的激活，而CRE抑制依赖于PKA活性。
本研究利用BRET等多种不同的技术手段，首次证实在APJ和KOR共表达的HEK293细胞中，APJ和KOR可靠地形成异源二聚物。经apelin-13或DynA（1-13）诱导后，PKC信号转导途径增强而PKA信号转导途径降低。深入分析APJ/KOR的异源二聚化作用为深入揭示二者在心血管系统和中枢神经系统参与的相关生理功能的细胞内分子机制提供新的实验依据，有助于阐明apelin在相关疾病发生中的作用机理，为相关药物的开发提供新的靶点，具有重要推广应用价值。