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柑橘青霉菌引起的青霉病是柑橘类水果最严重的采后病害之一,造成了严:重的经济损失。甾醇14α-脱甲基化酶抑制剂(DMIs)用于防治该种农业病害。DMIs是一组位点特异性杀真菌剂,可抑制CYP51酶的活性;而CYP51酶参与麦角固醇前体的14α-去甲基化过程,麦角固醇调节细胞膜的流动性和渗透性。DMIs的过量使用导致菌株对其产生了抗性,其靶标酶是CYP51。菌株对DMIs产生的抗性与CYP51过表达密切相关,CYP51的过表达与启动子有着紧密的关联。因此对启动子及其各种顺式作用元件的研究有重要意义。本文通过分子生物学及生物信息学等方法分析了意大利青霉菌(Penicillium italicum HSPi-N8中PiCYP51B的启动子结构,通过GFP融合表达的方法,构建了重组质粒并分析了启动子的功能,主要结果如下:1、从湖北各地及重庆、南昌等地采集并分离纯化得到柑橘青霉菌142株,其中意大利青霉58株,指状青霉(Penicillium digitotum)84株。检测了菌株对咪酰胺的抗药性表型。结果显示指状青霉中30株菌为抗性菌株,占指状青霉总数的36%,意大利青霉中30株菌为抗性菌株,占意大利青霉总数的52%。对部分菌株检测了其对咪酰胺的EC50值,最敏感的是HSPd-X10,EC50值为0.081mg/L;抗性最强的是HSPi-CQ3-2,EC50值为11.63mg/L,其他的菌株的抗性程度均不同。2、克隆了意大利青霉HSPi-N8的PiCYP51B基因的上游调控序列,使用NNPP在线分析软件预测HSPi-N8中PiCYP51B基因5’上游区转录起始位点,通过PlantCARE、PLACE等软件分析PiCYP51B基因下游调控元件及转录因子结合位点,找出了 PiCYP51B基因上游调控序列的调控元件。3、克隆了意大利青霉HSPi-N8的PiCYP51B基因全长启动子1003 bp,命名为PB1。通过GFP融合表达的方法,构建了 HSPi-N8的PiCYP51B基因全长启动子调控的重组质粒pTFCM-PB1-GFP-TtrpC、12个不同长度的PiCYP51B基因启动子缺失突变载体。所构建的载体通过农杆菌介导的转化成功导入意大利青霉基因组中。荧光显微镜下观察HSPi-N8的PiCYP51B基因全长启动子能够驱动GFP的表达而产生荧光。不同长度的PiCYP51B基因启动子驱动GFP的表达时,前7个长片段(PB2-PB8)能够驱动GFP的表达而产生荧光;后5个片段(PB9-PB13)不能够驱动GFP的表达,无荧光产生。说明PiCYP51B基因启动子的核心序列位于PB8(-218 bp)和PB9(-191 bp)之间。同时,在PB2(-367 bp)产生了较强荧光,而PB3(-338 bp)产生荧光强度正常,说明启动子在PB2到PB3之间存在关键元件。4、PlantCARE分析显示,在启动子序列-210 bp和-201 bp之间存在元件I-box,在-358 bp和-352 bp之间同一序列位点存在元件I-box和GATA-motif。分别在HSPi-N8的PiCYP51B基因全长启动子序列上定点缺失-210 bp和-201 bp之间的序列和-358 bp和-352 bp之间的序列,构建转化载体,分别命名为DI(缺失I-box)、DG(缺失GATA-motif)。经农杆菌介导意大利青霉的遗传转化得到转化子。荧光检测显示,当启动子缺失-210 bp到-201 bp之间的序列时(DI),在菌丝中观察不到荧光。当启动子缺失-358 bp到-352 bp之间的序列(DG),在菌丝中观察到正常强度的荧光,说明这两个区域中元件I-box和GATA-motif对PiCYP51B基因启动子非常重要。本文分离纯化了一批柑橘青霉菌,并研究了柑橘青霉菌中意大利青霉PiCYP51B基因启动子的结构与功能,为深入研究其靶标酶的功能奠定了良好基础,也为新型高效的抗真菌剂的研究提供理论依据。