肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae,SP)是社区获得性呼吸道感染的主要病原菌。老年人与普通成年人相比，社区获得性呼吸道感染的总发生率、相关的发病率和死亡率都更高。目前，对青霉素或红霉素耐药的肺炎链球菌在全球广泛流行。同时，多药耐药肺炎链球菌的流行情况也相当严峻。 目前，CARTIs的治疗指南中把β-内酰胺类抗生素和大环内酯类抗生素推荐做为一线用药。青霉素曾是治疗严重肺炎链球菌感染的首选用药，但是，自1967年澳大利亚首次分离出青霉素耐药肺炎链球菌以来，青霉素耐药肺炎链球菌(penicillin nonsuspective S. pneumoniae,PNSP)在全球各地陆续发现。青霉素结合蛋白(Penicillin Binding Proteins，PBPs)介导的靶位改变是肺炎链球菌对β-内酰胺类抗生素耐药的基础。 大环内酯类耐药肺炎链球菌(Macrolide-Resistant S.Pneumoniae，MRSP)的迅速增加也引起普遍关注。肺炎链球菌对大环内酯类抗生素的耐药机制主要有2种：由ermB介导的抗生素靶位改变和由mefA介导的外排泵出作用。近年来研究认为，mefA和ermB双阳性的SP菌株与大环内酯类高度耐药和多重耐药相关度高。 四环素曾经在发展中国家使用量很大。目前虽已逐渐退出临床，但是重要的病原菌对这些药物的耐药性流传甚广。肺炎链球菌对四环素的耐药性主要由tetM介导，也有少部分由tetO介导，这两个基因都编码核糖体保护蛋白。 Tn1545是与肺炎链球菌红霉素和四环素联合耐药关系密切的接合转座子。 它携带红霉素耐药基因ermB、四环素耐药基因tetM、氯霉素耐药基因CatpC194以及卡那霉素耐药基因aph3′-Ⅲ等基因。在呼吸道菌群中，由Tn1545介导的肺炎链球菌和其他菌种的耐药基因的种问交换，可与后续的抗生素选择压力共同导致多重耐药菌的产生。近年来，耐药肺炎链球菌在世界范围内的广泛流行已引起医学界的普遍关注。尽管耐药性监测和血清分型仍是主要的手段，但分子分型具有更好的鉴别力，可用于不同来源的具有相近亲缘关系的菌株检测。各种全基因组分型方法已经用于SP的常规分子分型，包括青霉素结合蛋白基因DNA指纹分型分析(DNAfingerprinting ofthe penicillin-binding protein genes)、BOX-PCR、脉冲场凝胶电泳多态性(Pulsed-Field Gel Electrophoresis，PFGE)、限制性片段末端标记方法(Restriction Fragment End L,abeling，RFEL)、多位点序列分型(MultilocusSequence Typing，MLST)等。 本课题选取分离自广州地区社区获得性呼吸道感染老年患者的33株肺炎链球菌，对其进行耐药性监测和分子流行病学研究。研究分4部分进行。第一部分在检测SP对8种常用抗生素的敏感性的基础上，与本地区及国内相关研究的耐药率和耐药模式比较，探讨广州地区社区获得性呼吸道感染老年患者肺炎链球菌临床分离株的耐药特点。第二部分研究本地区SP对青霉素的耐药特点，并验证PBP分型方法鉴定PSSP的特异性和灵敏度。第三部分研究肺炎链球菌对大环内酯类和四环素耐药的主要机制，及菌株对大环内酯类和四环素联合耐药的分子机制。第四部分用BOX-PCR分析菌株间亲缘关系，并用MLST技术检测部分多重耐药菌株的ST分型。 研究目的: 1.调查广州地区老年社区获得性呼吸道感染患者中，肺炎链球菌对常用抗生素的敏感性。 2.验证PBP分型方法鉴定PSSP的特异性和灵敏度，可否用此种简易快速的方法分辨PRSP与PSSP。 3.研究广州地区老年人肺炎链球菌分离株对大环内酯类和四环素的耐药机制。 4.分析广州地区老年患者肺炎链球菌多重耐药株的来源和亲缘关系。 研究方法: 1.自2004年6月到2005年12月在广州市第一人民医院采集社区获得性呼吸道感染老年患者的痰、支气管冲洗液、血培养等标本，培养分离，并用革兰染色镜检、菊糖发酵、胆汁溶菌等方法鉴定，最终确认为33株肺炎链球菌。 2.用K-B纸片扩散法测定肺炎链球菌对8种抗生素的敏感性。 3.用试剂盒提取肺炎链球菌基因组DNA；PCR扩增肺炎链球菌溶血素基因片段以鉴定SP；扩增青霉素结合蛋白基因pbpla，pbp2x，pbp2b。 4.PCR扩增大环内酯耐药基因ermB，mefA，及导致大环内酯类和四环素共同耐药的结合转座子Tn1545。 5.PCR扩增肺炎链球菌对四环素的耐药基因teM片段，并对回复突变体使用T载体进行全序列克隆测序，与GenBank标准序列对比以确定是否存在突变。 6.用盒式PCR(BOX-PCR)分析33株SP的亲缘关系。用多位点测序分型技术(MLST)检测4株多重耐药菌株的ST分型。 结果: 1.33株肺炎链球菌中有1株对青霉素中介耐药(MIC为0.125 mg/L)。肺炎链球菌对红霉素、克林霉素、四环素、甲氧苄啶磺胺甲噫唑表现出较高的耐药率，分别为分别为60.6％(n=20)，51.6％(n=17)、69.7％(n=23)和72.9％(n=24)。对氯霉素的耐药率为18.2％(n=6)，对环丙沙星的耐药率为27.2％(n=9)，对万古霉素均呈敏感。 2.75.8％(n=25)株对2种或以上抗生素联合耐药，耐3种以上不同种类抗生素的多重耐药株共19株，多重耐药率57.6％。最多见的耐药模式为红霉素、克林霉素、四环素及甲氧苄啶/磺胺甲噁唑联合耐药，为31.6％(n=6)，其次为红霉素、克林霉素与四环素及甲氧苄啶/磺胺甲嗯唑、环丙沙星联合耐药，为15.8％(n=3)。 3.用PCR方法检测PSSP准确率为68.75％(n=22)。纸片法验证为PSSP的菌株，pbp2b基因扩增率为87.5％(n=28)，pbp2x基因扩增率为75％(n=24)，pbp1a基因扩增率为12.5％(n=4)；中介耐药菌株759未扩增出pbp2b pbp2x基因，而pbp1a基因扩增结果为阳性。 4.20株红霉素不敏感肺炎链球菌中，有19株检测出mefA和/或ermB基因。其中仅ermB占57.9％(n=11)，ermB和mefA同时阳性占31.6％(n=6)，有2株未检测到ermB或mefA。同时携带ermB基因和mefA基因的6株肺炎链球菌均表现为多重耐药。 5.23株四环素不敏感肺炎链球菌的tetM基因株检出率是95.7％(n=22)，10株四环素敏感肺炎链球菌的tetM基因检出率为80％，四环素耐药回复突变率34.8％(n=8)。 6.33株肺炎链球菌中Tn1545的检出率是69.7％(n=23)。17株四环素和红霉素联合耐药的肺炎链球菌，Tn1545携带率为94.1％(n=16)。 7.34.8％(n=8)的四环素敏感株存在tetM耐药基因，四环素耐药回复突变株的tetM基因存在多处缺失、插入和点突变，且在前导序列的缺失导致移码突变。 8.BOX-PCR可将这33株肺炎链球菌分为21型。 9.MLST分型显示，4株多重耐药菌株分属ST271、ST236和ST905型。 结论: 1.广州地区社区获得性呼吸道感染的老年患者中，分离到的肺炎链球菌对青霉素耐药率较低，但对大环内酯类抗生素、四环素、甲氧苄啶＼磺胺甲噁唑耐药却非常普遍。对万古霉素均呈敏感。 2.多重耐药菌分离率高，耐药模式以大环内酯类合并四环素及甲氧苄啶＼磺胺甲噁唑为主。 3.用PCR方法检测PSSP准确率为68.75％(n=22)，有一定的可行性。 4.广州地区老年人肺炎链球菌临床分离株对红霉素和四环素耐药的主要机制分别是ermB编码的靶位改变和tetM编码的核糖体保护作用。 5.tetM基因变异可能是本地区肺炎链球菌对四环素耐药回复突变的机制之一。6.接合性转座子Tn1545的存在与tetM和ermB存在关系密切，可能是肺炎链球菌对大环内酯类药物和四环素等药物多重耐药的重要机制之一。 7.BOX-PCR显示了较高的分辨率，能快速可靠地检测菌株间的亲缘关系。 8.广州地区流行的耐药克隆与Taiwan19F-14同源，有本地起源和传入两种来源。