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多氯联苯(PCBs)作为一类持久性有机污染物和人类致癌物,因过去长达半个世纪的全球广泛使用和降解技术的缺乏,其污染分布持续到当前,仍十分普遍。按照PCBs苯环上氯取代基的个数,PCBs可分为低氯联苯(氯原子≤4个)和高氯联苯(氯原子>4个)。而低氯联苯在某些地区的空气中含量相当高,比高氯联苯更易通过吸入途径进入人体,进而发生代谢转化。本课题组前期工作已证实人类细胞色素P450酶系(CYPs)中的CYP2E1能特异性地激活PCBs,使其具有强致突变性,尤其在低氯化联苯上表现更为明显。然而,作为毒理学研究中常见的动物模型,小鼠CYP2E1对PCBs的代谢活化作用尚未得到研究。目的1.鉴于PCB 22在我们近年的研究中呈现出依赖人CYP2E1活性的最强致突变作用,本研究采用NIH小鼠肝细胞微核试验分析2,3,4’-三氯联苯(PCB 22)的体内遗传毒性。2.利用计算机分子模拟手段分析低氯化联苯作为底物与人和小鼠CYP2E1酶蛋白活性中心的分子对接情况,筛选出与小鼠CYP2E1酶具有较高亲和力的部分PCBs作为体外遗传毒性试验的受试物。3.观察细胞内2-氯联苯(PCB1)、2,3-二氯联苯(PCB5)、2,5-二氯联苯(PCB9)、PCB22及N-二甲基亚硝胺(NDMA,阳性对照化合物)对重组表达小鼠CYP2E1酶的中国仓鼠肺成纤维细胞(V79)衍生细胞(V79-mCYP2E1)诱发基因突变与微核的作用,并与采用表达人类同源酶相应细胞的实验结果相比较,以期为PCBs相关动物模型的受试物选择提供依据。方法1.NIH小鼠肝细胞微核(体内)实验采用腹腔注射方式对NIH小鼠在24 h内两次进行PCB 22染毒,玉米油为溶剂对照,N-二乙基亚硝胺(NDEA)为阳性对照,PCB 22分三个剂量组,每组9～～10只动物。末次染毒4 d后处死小鼠提取肝细胞用AO/DAPI染液染色,涂片、封片后在荧光显微镜下计数2000个肝细胞中含微核的细胞数。2.同源建模与分子对接通过SWISS-MODEL平台以人CYP2E1为模板,构建目标受体蛋白小鼠CYP2E1三维结构,再选取23个含1～3个氯取代基的PCBs作为配体小分子,利用Autodock 4.2模拟两者对接,筛选与小鼠CYP2E1酶具有较高亲和力的PCBs。3.体外细胞实验使用CCK-8试剂分别检测各受试物(PCB 1、PCB 5、PCB 9、PCB 22及NDMA)在不同剂量下对V79-Mz(对照细胞)和V79-mCYP2E1的细胞毒作用,选择合适的剂量以3h/21h(暴露/恢复)时程进行微核试验,以1d/2d时程进行Hprt致突变试验。4.蛋白质免疫印迹试验通过SDS-PAGE凝胶电泳、转膜、封闭、抗体孵育等流程鉴定CYP2E1在受试细胞系中的表达情况。结果1.基于PCB 22具有人CYP2E1依赖性最强遗传毒作用的前期观察,我们采用NIH小鼠肝细胞微核试验分析PCB 22的体内遗传毒作用。结果显示阳性对照化合物明显增高肝细胞的微核细胞率,然而PCB 22在相当大的一个剂量范围(170～2000 mg/kg)均呈阴性结果。2.对23个含1～3个氯取代基的PCBs分子与小鼠和人CYP2E1的分子对接结果显示,与小鼠和人CYP2E1有较佳亲和力的PCBs分别为9和17个,提示小鼠CYP2E1对低氯化联苯的活化作用可能弱于人类同源酶。3.将分子对接提示为小鼠CYP2E1底物的一、二氯联苯化合物PCB 1、PCB 5、PCB 9以及对接显示结合位点在活性中心之外的三氯联苯PCB 22以相关细胞遗传毒性试验进行验证。结果显示PCB 9对V79-mCYP2E1细胞诱发微核和Hprt基因突变,而对V79-Mz细胞无活性;PCB 1和PCB 5对二细胞系均在高浓度下诱导微核形成(细胞间未见差异),而致突变试验均呈阴性。PCB 22对V79-mCYP2E1细胞表现致突变作用,对V79-Mz则无活性;它对二细胞系均诱发微核,且强度相近。结论1.与人CYP2E1相比,小鼠CYP2E1在对低氯化联苯活化的作用明显较弱,存在巨大的种属差异。因此小鼠可能不适合作为研究CYP2E1依赖性PCBs遗传毒性的实验动物模型。2.在进行体内遗传毒性试验之前,最好以相关细胞遗传毒性试验和化合物与目标活化酶的分子对接筛试,以明确酶蛋白代谢活化作用的种属差异。如此可避免不必要的动物资源浪费。