随着抗生素的广泛应用,真菌耐药现象随之出现;同时由于近年来抗真菌药物研发进入瓶颈期,新抗生素的研发速度减慢,使得真菌耐药问题变得更加严峻。因此,为缓解或解决真菌临床耐药问题,耐药分子机制的解析愈发重要和急迫。本文研究了海盐对哈茨木霉的潮霉素B耐受性的影响及可能的作用因素,并结合哈茨木霉基因在不同培养条件下的转录情况对耐药机制和相关基因靶点进行分析。针对盐对真菌耐药性产生影响的问题,本文利用浓度梯度调控,研究了海盐对哈茨木霉的潮霉素B耐受性影响。研究结果表明海盐的存在会显著提高海洋来源的哈茨木霉对潮霉素B的耐受性,使耐药浓度从40 μg/mL提高至500 μg/mL。六株真菌的潮霉素耐受性实验结果表明,海盐对五株其他海洋或陆地来源的真菌（两株塔宾曲霉,两株黑曲霉和一株毛霉）也有同样的作用。同时,海盐也可提高哈茨木霉对同类氨基糖苷抗生素G418以及非同类抗真菌药物多菌灵的耐受性。但这并非是由于海盐引起的渗透压改变或潮霉素B与离子发生螯合导致的,主要起到作用的是海盐中存在的一些金属阳离子包括K+,Na+,Mg2+和Ca2+,且作用强度为Ca2+>K+>Mg2+>Na+。阴离子中SO42-可能对耐药性有一定作用,而Cl-和Br-几乎不起作用。对海盐和潮霉素B存在下哈茨木霉的转录情况进行分析,发现三种潜在的耐药机制。首先,海盐存在下真菌的细胞壁及其相关基因的表达量发生变化,细胞壁厚度变为原来的2.3倍,可能形成生物膜,一定程度上阻碍了药物的进入。其次,海盐和潮霉素诱导钠钾泵蛋白和药物转运蛋白的相关基因表达量上调,调节离子稳态及促进药物外排导致耐药性增加。最后,海盐和潮霉素可能激活了氨基糖苷钝化酶,使潮霉素B钝化从而提高哈茨木霉的耐受性。利用CRISPR Cas9技术对相关的显著差异表达基因进行敲除,突变株的耐药实验结果表明,编码钠钾泵蛋白的M431DRAFT₅12552基因在盐诱导哈茨木霉的潮霉素B耐药性产生上起到较大作用,在含有海盐的PDA上,600 μg/mL潮霉素B对突变株Δ512552的抑菌率比野生型低19.06%;17-β羟基类固醇脱氢酶突变株△504126对潮霉素B耐受性略有提高,在PDA和含有海盐的PDA上潮霉素B对突变株△504126的抑菌率分别比野生型低8.51%和7.50%;此外,氨基酸通道蛋白△506686突变株对潮霉素B的耐受性也略有变化,在普通PDA上对潮霉素B的最高耐受浓度从野生型的 50 μg/mL 提高至 70 μg/mL。本研究有望丰富真菌耐药机制的研究,为新的抗生素或药物研发提供可选择的作用靶点,这对临床合理使用抗真菌药物、降低耐药性菌株有重要意义。