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肿瘤的生长依赖于血管的新生,抑制肿瘤血管的生成已经成为一种肿瘤治疗的策略。Tumstatin(Ⅳ型胶原α3链的非胶原区域1)是一种内源性血管生长抑制因子,它与内皮细胞膜上的αvβ3整合素结合进而抑制内皮细胞蛋白的合成,导致内皮细胞凋亡,使肿瘤血管的生成受到抑制,抑制肿瘤细胞的生长、浸润和转移。Tum-5是由Tumstatin接近N端的54-132位氨基酸组成,为全长Tumstatin抗血管形成的功能结构域,以非RGD依赖的形式与整合素αvβ3结合来调节血管新生,与全长Tumstatin具有同等的抑制新生血管形成作用。NGR多肽(CNGRCVSGCAGRC)是利用噬菌体表面呈现技术筛选得到的能够与活化的肿瘤新生血管内皮细胞特异性结合的多肽序列。其受体是高表达于肿瘤血管内皮细胞的CD13/APN分子。CD13/APN是新生血管形成过程中的一个重要调节分子,主要参与血管内皮细胞的迁移和浸润。利用NGR的这一特性,已成功得将化疗药物、TNF、诱导凋亡的短肽等抗肿瘤药物靶向性地运输到肿瘤组织的新生血管处,既提高了药物的疗效又明显降低了毒副作用。本实验中将NGR多肽编码序列与Tum-5基因重组,表达了肿瘤新生血管靶向的血管生成抑制因子(Tum-5-NGR)。我们希望该融合蛋白通过NGR多肽与肿瘤新生血管内皮细胞上的CD13/APN结合,既能使Tum-5在肿瘤组织的新生血管处富集,针对性地发挥它的抑制肿瘤血管形成和抗肿瘤作用;又可以起到抑制CD13/APN介导的新生血管形成作用,从而降低临床用药量,提高量效比,同时降低毒副作用。由于后续实验对表达的Tum-5蛋白进行免疫印迹和其它检测都需要用到相应抗体,而目前还没有针对Tum-5的商业化抗体及ELISA检测试剂盒,因此首先以原核细胞表达的Tum-5蛋白免疫动物制备了兔抗Tum-5多克隆抗体。将Tum-5及Tum-5-NGR基因克隆入真核表达载体pcDNA3.1(pcDNA-tum-5 /pcDNA-tum-5-NGR),分别稳定转染CHO细胞,通过G418抗生素筛选得到能持续分泌表达融合蛋白的细胞株。分泌重组蛋白对稳转细胞自身生长没有影响。体外试验中,含有重组蛋白的分泌型细胞培养上清可对血管内皮细胞的增殖、小管形成和运动迁移能力形成明显抑制。重组质粒于小鼠胫前肌注射后提取肌肉组织RNA进行RT-PCR分析,检测到外源基因mRNA水平上的表达。抑瘤实验结果显示,与空载体对照组相比,重组质粒pcDNA-tum-5或pcDNA-tum-5-NGR均能实现对肿瘤组织生长的显著抑制,抑瘤率分别达到29.4%与54.1%。其中pcDNA-tum-5-NGR靶向治疗组抑制肿瘤生长的作用明显优于pcDNA-tum-5治疗组。肿瘤组织HE与CD31染色表明pcDNA-tum-5-NGR靶向治疗组较pcDNA-tum-5治疗组肿瘤组织内新生血管密度显著减少。Pichia pastoris酵母表达系统是近年发展起来的具有高效分泌表达能力的真核表达系统。以酵母分泌表达重组蛋白,表达产物直接分泌到培养基中,且上清中杂蛋白含量低,可以简化纯化工艺。因此,我们将Tum-5及Tum-5-NGR基因分别克隆入分泌型酵母表达载体pPICZaA(pPICZaA-tum-5/pPICZaA-tum-5-NGR),重组质粒电转化酵母后以甲醇诱导表达,SDS-PAGE及Western blot免疫印迹检测到目的蛋白条带。综上所述,本文首先研究构建pcDNA-tum-5与pcDNA-tum-5-NGR重组真核表达质粒,证实了重组质粒能够在体外和体内高效分泌表达目的蛋白。细胞实验显示分泌型CHO细胞培养上清可特异性抑制血管内皮细胞增殖与迁移;动物实验中两种重组质粒给药均能有效抑制小鼠肿瘤的生长,并且以NGR多肽作为导向分子表达融合蛋白可以明显增强Tum-5对肿瘤的杀伤作用。在此基础上我们进一步探讨了以毕赤酵母系统分泌表达重组蛋白的可能性,为建立中试规模的发酵和纯化工艺做出了初步研究。