肝纤维化(hepatic fibrosis, HF)发生的中心事件是由于肝星状细胞(hepatic stellate cell, HSC)激活,细胞外基质(extracellular matrix, ECM)生成过多、降解相对不足,在肝内大量沉积,而Ⅰ型胶原占沉积ECM的70%以上。在HF恢复期,HSC凋亡明显增多,一方面消除了ECM的来源,另一方面也解除了金属蛋白酶组织抑制物(tissue inhibitor of metalloproteinase, TIMP )对基质金属蛋白酶( matrix metalloproteinases, MMPs)的抑制作用,从而促进胞外基质的降解。因此,诱导活化HSC凋亡可使HF发生逆转。NF-κB(nuclear factor kappa B, NF-κB)在多种细胞中高表达,不同的Rel/NF-κB家族成员可以结合成不同的二聚体。在这些二聚体中,最常见的形式是由p50和p65组成的异源二聚体。在绝大多数静止期的细胞中,NF-κB与其抑制物IκB(the inhibitor ofκB, IκB)蛋白相结合,以非活性形式存在于细胞质中。NF-κB可以被多种刺激物所激活,如TNF-α、IL-1、脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)等,这些刺激物可以通过对IκB的磷酸化而使其降解,并与NF-κB解离,暴露NF-κB的核识别位点,使其进入核内,促进下游的靶基因的转录。NF-κB的激活在细胞生存、黏附、分化和细胞生长中起关键作用。而且,活化的NF-κB信号通路通过上调其下游的靶基因如COX2、cyclinD1、bcl-2等,抑制细胞的凋亡。并且实验发现NF-κB的激活通过阻止Caspase-8的激活抑制了Caspase的起始,从而抑制了Caspase-3的激活,进一步抑制细胞的凋亡。研究表明,在静止态HSC中NF-κB并无活性,但在激活态HSC中,活性却持续存在,因此有理由相信NF-κB可能通过抑制HSC的凋亡而使活化的HSC数量维持在相当的水平,最终导致肝纤维化的发生。NF-κB的这一特性,使得这个转录因子成为一个有前途的分子靶点。RNA干扰(RNA interference, RNAi)技术是目前研究基因功能强有力的工具之一,能够用于研究特定基因的表达抑制。迄今为止,NF-κB参与多种炎症、免疫、细胞增殖和凋亡等病理、生理过程的调控已见较多报道,但NF-κB在肝纤维化及HSC增殖、凋亡中的作用报道甚少。为此,本研究应用体外细胞培养技术,以LPS激活NF-κB,利用RNAi技术特异性的抑制NF-κB亚单位p65的表达,研究活化的NF-κB表达受到抑制后,对HSC凋亡的影响及其可能机制,抑制肝纤维化作用。目的:应用p65shRNA转染HSC,探讨p65shRNA对NF-κB表达的影响,以及对HSC凋亡的影响及其可能机制。方法:应用含2%胎牛血清、100IU·mL-1青霉素、100μg·mL-1链霉素、4mmol·L-1谷氨酰胺及1mol·L-1 HEPES的DMEM培养液,37℃、5%CO2条件下体外培养HSC。应用RNAi技术特异性的抑制NF-κB亚单位p65的表达,通过荧光显微镜筛选出荧光素标记的对照shRNA在HSC中转染效率最高的最佳浓度和作用时间;Western blotting方法检测HSC中p65及其下游抗凋亡蛋白bcl-2的表达;采用流式细胞仪、TUNEL染色及DNA ladder法检测p65shRNA对HSC凋亡的影响;采用Caspase-3活性试剂盒检测p65shRNA对Caspase-3活性的影响;明胶酶谱法测定明胶酶的活性;RT-PCR共扩增技术检测Ⅰ型前胶原mRNA表达。结果:①shRNA转染HSC的效率:将荧光素标记的对照shRNA转染HSC,通过荧光显微镜观察转染效率,结果显示200pmol shRNA组转染72h效率最高,可达90%以上。②p65shRNA转染HSC后对NF-κB的阻断作用:Western blot结果表明,LPS作用于HSC后,p65蛋白表达量显著高于空白对照组(2.34±0.26 vs 0.61±0.11),升高了227.42%,P<0.01;但与脂质体组、阴性对照组比较无明显差异,P>0.05。p65shRNA转染HSC 72h后, p65蛋白表达量显著降低(0.27±0.09 vs 2.19±0.26),较阴性对照组降低87.67%,经统计学处理有显著性差异,P<0.01。③p65shRNA对HSC凋亡的影响:流式细胞仪和TUNEL染色法测定均显示:经LPS处理后,LPS组、脂质体组与阴性对照组间无组间差异,P>0.05,均低于空白对照组,P<0.05;p65shRNA转染HSC 72h后,与空白对照组、LPS组、脂质体组与阴性对照组相比,可明显促进细胞的凋亡。表明在LPS激活NF-κB后,抑制HSC凋亡,而p65shRNA转染组特异性抑制NF-κB表达后,可有效的促进细胞凋亡。DNA ladder检测中p65shRNA转染组出现梯状条带,也表明p65shRNA转染HSC 72h后,可促进细胞的凋亡。④p65shRNA阻断NF-κB信号通路下调bcl-2的表达:Western blot结果表明,LPS作用于HSC后,bcl-2蛋白表达量显著高于空白对照组(1.80±0.07 vs 0.59±0.11),升高了205.08%,P<0.05;但与脂质体组、阴性对照组比较无明显差异,P>0.05。p65shRNA转染HSC 72h后,bcl-2蛋白表达量显著降低(0.31±0.14 vs 1.17±0.06),较阴性对照组降低81.87%,经统计学处理有显著性差异,P<0.01。表明在LPS激活NF-κB后,促进其下游调控基因bcl-2的表达,而p65shRNA转染组特异抑制NF-κB表达后,可下调bcl-2的蛋白表达。⑤p65shRNA阻断NF-κB信号通路激活Caspase-3活性:Caspase-3活性检测显示:经LPS处理后,LPS组、脂质体组与阴性对照组间无组间差异,P>0.05;均低于空白对照组,P<0.05;p65shRNA转染HSC 72h后,与空白对照组、LPS组、脂质体组与阴性对照组相比,可明显增高Caspase-3活性,P<0.01。表明在LPS激活NF-κB的表达后,Caspase- 3活性受抑;而p65shRNA转染组特异抑制NF-κB表达后,可有效的激活Caspase-3活性。⑥p65shRNA阻断NF-κB信号通路增强明胶酶活性:明胶酶谱法测定:p65shRNA转染HSC 72h后,与空白对照组、LPS组、脂质体组与阴性对照组相比,可明显增高明胶酶活性,P<0.01。表明p65shRNA转染组特异抑制NF-κB表达后,可有效的增强明胶酶活性。⑦p65shRNA阻断NF-κB信号通路后下调Ⅰ型前胶原表达:RT-PCR共扩增检测Ⅰ型前胶原和内参GAPDH基因表达,扫描结果分析显示:p65shRNA转染HSC 72h后,与空白对照组、LPS组、脂质体组与阴性对照组相比,Ⅰ型前胶原表达明显降低,有明显统计学意义,P<0.01。结论:RNA干扰技术是研究基因功能的强有力的手段之一,p65shRNA可以特异性的阻断NF-κB基因表达;可以促进HSC的凋亡,其机制可能与下调NF-κB下游基因中抗凋亡蛋白bcl-2的表达,和激活Caspase途径有关,从而抑制肝纤维化。