研究背景目前,肝细胞肝癌在中国已经成为危害人类健康的重要疾病。随着肿瘤研究的深入,肿瘤微环境的概念逐渐被人们认识。肿瘤微环境是指肿瘤细胞在发生发展过程中所处的内环境,其中包括浸润的免疫细胞,基质细胞,大量炎性因子,以及肿瘤组织所处环境中的氧含量和pH值等。这些复杂的环境因素也表现出极为复杂的功能,在肿瘤微环境中,既有起促炎作用的Thl和Th17淋巴细胞,也有抑炎的Th2和Treg淋巴细胞；既有促炎作用的TNF-α,IL-6和IL-12等细胞因子,也有起抑炎作用的TGF-β,IL-4和IL-10等细胞因子。这些不同功能的细胞和细胞因子对于肿瘤的发生发展有着重要的影响。研究发现,在肿瘤微环境中存在着一群数量庞大,功能复杂的细胞群体-肿瘤相关巨噬细胞,随着研究的深入,这一群功能复杂的细胞群体的功能被不断的揭示。为了后续研究方便,研究者们根据其表型和功能的不同将巨噬细胞分成了M1样巨噬细胞和M2样巨噬细胞。这种分型可以帮助研究者们细化对巨噬细胞功能的研究,进而更准确的揭示肿瘤相关巨噬细胞的不同功能。随着肿瘤免疫疗法的不断发展,在CTLA-4单克隆抗体应用于临床肿瘤的治疗之后,又一种以“明星分子”-PD-L1为靶标的治疗抗体被FDA批准用于临床黑色素瘤和非小细胞肺癌的治疗。目前,PD-L1作为一个重要的免疫抑制分子,主要表达在APC细胞和某些肿瘤细胞表面,而其受体PD-1主要表达在T淋巴细胞表面。当表达在APC细胞或肿瘤细胞表面的PD-L1与表达在T淋巴细胞表面的受体PD-1结合后,可抑制T淋巴细胞活化信号的传递,从而抑制T淋巴细胞的增殖,分化和效应功能,使T淋巴细胞处于一种“免疫失能”状态。随着针对PD-L1:PD-1研究的的深入,发现IFN-γ,lL-27以及缺氧的环境都可以上调肿瘤细胞免疫抑制分子PD-L1的表达。正如前文所述,复杂的肿瘤微环境中很有可能就包含细胞因子IFN-γ,IL-27以及缺氧的状态,另外,在肿瘤微环境中可能还存在未被揭示的诱导肿瘤细胞PD-L1高表达的机制。综上,肿瘤微环境中存在着数量庞大且具有不同功能状态的巨噬细胞-M1样巨噬细胞和M2样巨噬细胞,那么,这些不同功能的巨噬细胞是否能够上调肿瘤细胞PD-L1的表达?如果能够上调肿瘤细胞PD-L1的表达,具体的机制又是什么?最后,由肿瘤相关巨噬细胞引起的肿瘤细胞PD-L1的高表达是否能够抑制T淋巴细胞的免疫功能?目前,这些问题还没有被揭示,对于这些问题还需要用进一步的实验证据来证明。研究目的针对以上我们提出的问题,本研究将以人肝癌组织石蜡切片,人肝癌细胞系和小鼠肝癌细胞系为研究对象,证明肿瘤细胞PD-L1的过表达是否受到M1样或M2样巨噬细胞的调控。同时,通过体外细胞实验探究巨噬细胞是通过什么机制上调肿瘤细胞免疫抑制分子PD-L1的表达。最后,我们将活化的小鼠T淋巴细胞与小鼠肝癌细胞共培养,进而证明巨噬细胞引起的肿瘤细胞PD-L1的过量表达能否抑制T淋巴细胞的功能。研究方法及结果1、人肝癌组织中巨噬细胞活化类型免疫组织化学分析。我们通过运用免疫双染的方法,使用CD68和HLA-DR作为表面标志,对临床肝癌组织石蜡切片进行免疫组织化学双染。然后,用显微镜高倍视野观察并分析拍照图片。实验结果表明人肝癌组织中含有CD68+HLA-DR+的M1样巨噬细胞和CD68+HLA-DR的M2样巨噬细胞；与癌巢相比,癌旁的炎症部位浸润更多的CD68+HLA-DR+的M1样巨噬细胞。2、人肝癌组织免疫组织化学染色显示PD-L 1表达呈异质性,且与M1样巨噬细胞浸润的数量有相关系。我们对30例人肝癌组织石蜡切片进行免疫组织化学染色,实验结果显示免疫抑制分子PD-L1在肝癌组织中的阳性率为20%,而且其表达呈异质性。然后,进行石蜡组织连续切片免疫组化染色实验,即同一组织两张连续切片,其中一张使用CD68和HLA-DR两个指标进行免疫双染,另一张进行PD-L1染色,待染色完成后,使用显微镜高倍镜观察并拍照,结果显示,CD68+HLA-DR+的M1样巨噬细胞浸润多的部位PD-L1的表达较强。3、小鼠RAW264.7来源的M1样巨噬细胞促进了小鼠肝癌细胞免疫抑制分子PD-L1的表达。我们采用LPS和IL-4进行体外诱导小鼠巨噬细胞系RAW264.7,得到M1样巨噬细胞和M2样巨噬细胞。刺激48h后,分别获得M1样和M2样巨噬细胞的上清,将其制成条件培养基,用以刺激小鼠肝癌细胞系Hepa1-6细胞。通过RT-PCR和流式细胞术的方法检测小鼠肝癌细胞Hepa1-6的PD-L1分子表达情况,实验结果显示M1样巨噬细胞可以在mRNA水平和蛋白水平上调小鼠肝癌细胞系Hepa1-6细胞PD-L1分子的表达。4、小鼠骨髓来源的M1样巨噬细胞促进了小鼠肝癌细胞免疫抑制分子PD-L1的表达。我们首先采用M-CSF在体外诱导小鼠骨髓细胞,来获得小鼠骨髓来源的巨噬细胞,然后采用LPS和IL-4进行体外刺激小鼠骨髓来源巨噬细胞,得到M1样巨噬细胞和M2样巨噬细胞。刺激48h后,分别获得M1样和M2样巨噬细胞的上清,将其制成条件培养基,用以刺激小鼠肝癌细胞系Hepa1-6细胞。通过RT-PCR和流式细胞术的方法检测小鼠肝癌细胞Hepa1-6的PD-L1分子的表达情况,实验结果显示M1样巨噬细胞可以在mRNA水平和蛋白水平上调小鼠肝癌细胞系Hepa1-6细胞PD-L1分子的表达。5、人THP-1来源的M1样巨噬细胞促进了人肝癌细胞免疫抑制分子PD-L1的表达。我们首先采用PMA在体外诱导人白血病单核细胞系THP-1,来获得巨噬细胞,然后采用LPS和IL-4进行体外刺激THP-1来源的巨噬细胞,得到M1样巨噬细胞和M2样巨噬细胞。刺激48h后,分别获得M1样和M2样巨噬细胞的上清,将其制成条件培养基,用以刺激人肝癌细胞系HuH-7细胞。通过RT-PCR和流式细胞术的方法检测人肝癌细胞HuH-7细胞PD-L1分子的表达情况,实验结果显示M1样巨噬细胞可以在mRNA水平和蛋白水平上调人肝癌细胞系HuH-7细胞PD-L1分子的表达。6、小鼠M1样巨噬细胞通过MEK/ERK信号通路促进了小鼠肝癌细胞免疫抑制分子PD-L1表达。采用LPS进行体外诱导小鼠巨噬细胞系RAW264.7,得到M1样巨噬细胞。刺激48h后,获得M1样巨噬细胞的上清,加入针对NF-KB, PI3K, ERK, P38, JAK, JNK,和STAT3的化学抑制剂将其制成条件培养基。在加入条件培养基之前,加入含有以上七种化学抑制剂的完全培养基作用1h。之后,把上述的含有七种化学抑制剂的条件培养基加入小鼠肝癌细胞系Hepa1-6细胞的培养板中培养24h。通过流式细胞术检测小鼠肝癌细胞系Hepa1-6细胞PD-L1分子的表达情况。实验结果表明加入ERK信号通路化学抑制剂后,小鼠肝癌细胞系Hepa1-6细胞免疫抑制分子PD-L1的表达较M1样巨噬细胞上清刺激组明显下降。7、小鼠M1样巨噬细胞通过分泌细胞因子TNF-a促进了小鼠肝癌细胞Hepal-6免疫抑制分子PD-L1的表达。采用LPS刺激小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞48h后,获得M1样巨噬细胞的上清,再加入细胞因了TNF-α,IL-6和IFN-γ的中和抗体及同型对照抗体室温中和。之后再把上述经中和抗体作用的M1样巨噬细胞的上清加入到小鼠肝癌细胞系Hepa1-6细胞的培养板中。经培养后处理,并进行流式细胞术检测。实验结果显示加入细胞因子TNF-α的中和抗体作用后,小鼠肝癌细胞系Hepa1-6细胞免疫抑制分子PD-L1的表达较同型对照组明显下降。8、人M1样巨噬细胞通过JAK/STAT信号通路促进了人肝癌细胞免疫抑制分子PD-L1的表达。采用LPS刺激人THP-1来源的巨噬细胞,得到Ml样巨噬细胞。刺激48h后,获得M1样巨噬细胞的上清,加入针对NF-KB,PI3K, ERK, P38, JAK, JNK,和STAT3的化学抑制剂将其制成条件培养基。在加入条件培养基之前,加入含有以上七种化学抑制剂的完全培养基作用1h。之后,把上述的含有七种化学抑制剂的条件培养基加入人肝癌细胞HuH-7细胞的培养板中。通过流式细胞术检测人肝癌细胞HuH-7细胞PD-Ll的表达情况。实验结果表明加入JAK信号通路化学抑制剂后,人肝癌细胞系HuH-7细胞的免疫抑制分子PD-L1的表达较M1样巨噬细胞上清刺激组明显下降。9、M1样巨噬细胞上清刺激的小鼠肝癌细胞促进了CD8+T淋巴细胞的凋亡用LPS刺激小鼠巨噬细胞RAW264.7获得M1样巨噬细胞上清,用此上清刺激小鼠肝癌细胞Hepa1-6。再将体外诱导的非特异性扩增的T淋巴细胞与上述经M1样巨噬细胞上清刺激的肝癌细胞共培养,用流式细胞术的方法检测CD8+T淋巴细胞的凋亡情况。实验结果显示M1样巨噬细胞上清刺激后的肝癌细胞促进了CD8+T淋巴细胞的凋亡。结论1、免疫抑制分子PD-L1在肝癌组织中呈异质性表达,并且肝癌组织PD-L1分子的表达与M1样巨噬细胞浸润的数量有关系。2、M1样巨噬细胞可以上调肝癌细胞免疫抑制分子的表达。3、M1样巨噬细胞通过不同的信号通路促进了PD-L1分子在人和小鼠的肝癌细胞中的表达。4、M1样巨噬细胞刺激的肝癌细胞促进了CD8+T淋巴细胞的凋亡。创新性和意义作为针对免疫抑制分子PD-L1为靶点的免疫疗法正取得突破性的进展。但是,限于目前的研究,对肿瘤细胞PD-L1分子表达调控的机制仍需要被进一步的揭示。本研究从肿瘤微环境的角度探究了肿瘤相关巨噬细胞对肿瘤细胞表达免疫抑制分子PD-L1的调控机制,揭示了肿瘤微环境中M1样巨噬细胞通过相应的信号通路促进了免疫抑制分子PD-L1的上调表达。拓展了人们对免疫抑制分子PD-L1表达调控的新认识,为靶向PD-L1分子的肿瘤免疫治疗带来了新的思考,提示人们可以针对PD-L1分子表达调控关键通路中的分子为靶点,设计小分子药物来阻断免疫抑制分子PD-L1的过量表达,进而提高肿瘤的治疗效果。并且,由于M1样巨噬细胞能够促进免疫抑制分子PD-L1的表达,也提示在靶向巨噬细胞治疗的方案中应考虑到不同活化状态的巨噬细胞对肿瘤发生发展的不同作用。