“糖脂清”对糖尿病合并认知功能障碍小鼠神经元凋亡的影响及机制研究

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目的:本研究旨在通过动物实验探讨“糖脂清”对DCD小鼠学习记忆缺陷改善作用及海马组织神经元异常凋亡的保护作用,通过细胞实验探讨“糖脂清”对高糖诱导HT22细胞损伤的具体作用机制。方法:(1)利用TCMSP、TCM@Taiwan数据库筛选“糖脂清”的有效化学成分,通过OMIM、TTD、Genecards、PharmGkb 和 Drugbank 数据库获取 DCD 疾病靶点;运用 Stitch、String数据库、导入Cytoscape 3.8.0软件构建药物靶点—疾病的PPI网络,并通过该软件内CytoNCA插件实现相关网络拓扑分析,由此筛选、获得核心靶点。通过DAVID数据库对筛选出的核心靶点进行GO功能和KEGG通路富集分析,利用R Studio进行可视化输出。将“糖脂清”高度值的主要活性成分与核心靶点进行分子对接验证。(2)将75只C57BL/6J小鼠随机分为空白组、模型组、二甲双胍组、“糖脂清”低剂量组、“糖脂清”中剂量组和“糖脂清”高剂量组,造模组小鼠采用高脂高糖饲料联合STZ腹腔注射复制T2DM小鼠模型,造模成功后给予不同剂量“糖脂清”和二甲双胍干预8周。通过Morris水迷宫实验检测各组小鼠学习记忆能力;采用ELISA法检测GHb、FINS水平,并计算HOMA-IR、ISI指数以评估每组小鼠胰岛素抵抗状态;检测各组小鼠氧化应激指标SOD和MDA含量;TUNEL法检测小鼠海马区神经元凋亡;Western blot法检测各组小鼠海马组织Bax、Bc12、Caspase3、Caspase8表达水平情况。(3)制备二甲双胍和不同剂量“糖脂清”的大鼠含药血清,采用高糖对HT22进行造模诱导,给予“糖脂清”高、中、低剂量和二甲双胍含药血清对高糖环境下的HT22细胞进行干预。检测各组HT22细胞氧化应激指标SOD、MDA和LDH含量;免疫荧光法和Hoechst 33342染色检测神经元凋亡和Lamp2的表达情况;Western blot法检测各组HT22细胞凋亡、自噬相关蛋白Bax、Bc12、Caspase3、SIRT1、JNK表达水平。结果:(1)经网络药理学分析后共获得“糖脂清”64个活性成分,共筛选出1490个疾病靶点。通过对药物靶点—疾病PPI网络进行拓扑分析获得27个核心靶点参与DCD的治疗,GO功能和KEGG通路富集分析涉及48个生物学过程、6个细胞组成、15个分子生物学功能以及81条信号通路。揭示了“糖脂清”可能通过TNF信号通路、Toll样信号通路、FoxO信号通路、HIF-1信号通路、胰岛素信号通路、神经营养因子信号通路等多条信号通路起到调节神经元自噬、改善内质网应激、抑制细胞凋亡、抗炎、抗氧化、调节突触可塑性和传导的作用。在分子对接结果得出AKT1、IL6、TP53与槲皮素、β-谷甾醇结合紧密。(2)Morris水迷宫测试结果显示,与空白组相比,模型组小鼠逃避潜伏期时间延长(P<0.05),在空间探索试验中其穿越平台次数明显减少(P<0.05)。与模型组相比,经“糖脂清”和二甲双胍干预后的小鼠逃避潜伏期明显缩短(P<0.05),穿越平台次数增加(P<0.05),且各剂量中药组与二甲双胍组相较无明显差异。(3)与对照组相比,模型组小鼠体内GHb、HOMA-IR增高,FINS、ISI水平明显降低(P<0.05)。与模型组相比,二甲双胍组和“糖脂清”低剂量组能降低GHb和HOMA-IR水平,提高FINS和ISI含量(P<0.05),“糖脂清”中剂量组可提升FINS水平(P<0.05),“糖脂清”高剂量组能降低GHb水平,提高FINS水平(P<0.05)。(4)与对照组相比,模型组小鼠体内MDA表达水平增高,SOD水平降低(P<0.05)。与模型组相比,二甲双胍组和“糖脂清”各剂量组能降低MDA水平,提高SOD水平(P<0.05),各剂量中药干预组与二甲双胍组间无明显差异。(5)与对照组相比,模型组小鼠海马区神经元凋亡水平增高,Bax、Caspase3、Caspase8表达增加,Bcl2表达降低(P<0.05)。与模型组相比,二甲双胍组和“糖脂清”各剂量组能降低海马区细胞凋亡水平,抑制Bax、Caspase3、Caspase8蛋白表达,上调Bcl2蛋白表达水平(P<0.05)。(6)与对照组相比,模型组HT22细胞生长异常、形态发生改变。与模型组相比,“糖脂清”能够改善调节HT22细胞在长期高糖环境下细胞生长和形态变化。(7)与对照组相比,模型组细胞MDA、LDH水平增高,SOD水平降低(P<0.05)。与模型组相比,“糖脂清”各剂量组能降低MDA和LDH水平,提高SOD含量(P<0.05),二甲双胍虽能降低MDA和LDH水平(P<0.05),但在提升SOD含量方面效果不显。(8)与对照组相比,经高糖诱导后的模型组细胞凋亡水平增高,其Bax、Caspase3、SIRT1、JNK蛋白表达增加,Bc12、Lamp2蛋白表达降低(P<0.05)。与模型组相比,二甲双胍组可显著下调SIRT1、Bax蛋白的表达水平(P<0.05),上调Lamp2蛋白表达量(P<0.05),“糖脂清”低剂量组显著下调Bax表达量(P<0.05),中剂量组能上调Lamp2表达水平(P<0.05),高剂量组能显著上调Bcl2、Lamp2蛋白表达量(P<0.05)。而在Caspase3、JNK和SIRT1蛋白调控方面,“糖脂清”各剂量组均能下调其表达水平,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:(1)“糖脂清”能够改善T2DM小鼠的认知功能障碍,提高学习记忆能力,同时能够调节海马炎症凋亡相关因子Bax、Bcl2、Caspase3、Caspase8蛋白的表达,显著减少海马区域神经元凋亡。(2)“糖脂清”显著缓解海马区域神经元凋亡和氧化应激异常状态,调控自噬体与溶酶体的结合过程,在一定程度上抑制细胞自噬。
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