血吸虫病是由血吸虫感染引起的一种人兽共患寄生虫病,调节性B细胞(Bregs)是一类具有免疫负向调节作用的B细胞亚群,通过分泌IL-10、TGF-β等细胞因子,在自身免疫病、慢性炎症、肿瘤及寄生虫感染等疾病中发挥着免疫抑制作用。近年来研究表明,曼氏血吸虫感染后可以诱导高分泌IL-10的Bregs(B10细胞)产生,并且在抑制自身免疫病过程中发挥重要的作用。课题组在前期工作中已经证实日本血吸虫虫卵抗原(SEA)在体内、体外均可以诱导产生B10细胞,然而,在血吸虫感染不同阶段B10细胞的动态变化及其表型仍不明确,B10细胞对其他细胞的免疫调控作用仍不清楚。此外,日本血吸虫感染诱导B10细胞活化的机制尚不明确。因此,我们对日本血吸虫感染C57BL/6小鼠后B10细胞的免疫学特性进行了研究。研究内容分为3部分：1.日本血吸虫感染不同阶段B10细胞的动态变化目的：通过体内动物实验观察血吸虫感染的不同阶段B10细胞的动态变化。方法：构建日本血吸虫感染C57BL/6小鼠的模型,分别在感染Ow、3w、6w、 13w, ELISA检测血清中SEA特异性抗体IgG、IgG1和IgG2a的变化,ELISA法检测血清IL-10以及脾脏CD19+B细胞体外培养上清中IL-10、IL-4、IFN-γ的水平,同时流式检测脾脏中CD19+IL-10+B细胞的比例。感染13w时通过胸主动脉灌注得到成虫,KOH消化肝脏后显微镜下计数虫卵,计算每对成虫产卵个数,同时镜下观察感染各时期肝脏的病理改变。结果：小鼠血清中,可溶性虫卵抗原(SEA)特异性IgG、IgGl、IgG2a抗体水平显著增高。日本血吸虫感染后的第6w和第13w,脾脏B细胞分泌的IL-10水平也显著升高,IFN-γ以及IL-4水平无明显改变。同时,感染后6w和13w,B10细胞比例也显著增多。感染后第13w,可收集到成虫,肝脏有沉积虫卵和虫卵肉芽肿的形成。结论：在日本血吸虫感染急性和慢性期,日本血吸虫可以诱导小鼠脾脏产生B10细胞。2.日本血吸虫感染诱导产生的B10细胞的表型和功能目的：探索血吸虫感染过程中B10细胞的表型和功能。方法：感染第13w磁珠分离小鼠脾脏CD19+B细胞,标记表面抗体,流式检测CD19+CD1d+CD5+以及CD19+Tim-1+两种B10细胞的比例,然后根据表型流式分选细胞,体外培养后检测上清中IL-10水平,明确分泌IL-10的B细胞表型。根据表型流式分选B10细胞然后与磁珠分选出的CD4+T细胞共孵育,同时加入抗CD3抗体和抗CD28抗体,72h后,ELISA法检测细胞上清中IL-4、IFN-γ以及IL-17的水平。结果：CD19+Tim-1+B细胞高分泌IL-10,并且这群细胞能够诱导活化的CD4+T细胞分泌IL-4,并抑制IL-17的分泌。结论：在日本血吸虫感染过程中,CD19+Tim-1+B细胞可以对Th2和Th17细胞产生调节作用。3.日本血吸虫诱导B10细胞活化机制的初步探讨目的：研究日本血吸虫诱导B10细胞活化的机制。方法：体外用SEA、LPS分别刺激正常小鼠CD19+B细胞,通过实时荧光定量PCR方法检测CD19+B细胞TLR2、TLR4以及IL-10的mRNA水平。磁珠分选正常小鼠和TLR4-/-小鼠脾脏CD19+B细胞,SEA、LPS分别刺激72h后,流式检测IL-10+B细胞的比例,同时ELISA检测上清中IL-10的水平。结果：SEA和LPS刺激后,CD19+B细胞TLR4以及IL-10的mRNA的表达水平明显升高；TLR4-/-小鼠CD19+B细胞在SEA和LPS刺激后,IL-10+B细胞比例以及分泌IL-10的量显著低于正常小鼠。结论：SEA诱导产生B10细胞部分依赖于TLR4途径。通过小鼠体内、外实验,对日本血吸虫感染过程中B10细胞动态变化、表型、功能以及诱导B10细胞活化的机制的研究,有助于我们进一步了解日本血吸虫感染过程中的免疫调控机制,同时为探索血吸虫感染疫苗研制提供了依据。