本试验以临床使用的抗生素为对照，选取大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等有害菌和乳酸杆菌、双歧杆菌等有益菌为试验菌株，采用肉汤微量稀释法、薄层琼脂糖孔穴扩散法和时间动态曲线法等方法在体外测定了天然乳铁蛋白(LF)、乳铁蛋白肽(Lfcin)以及重组猪乳铁蛋白(rPLF，包括草地夜蛾Sf9细胞和试验蚕蛹)的抗菌效果，并通过原子力显微镜等手段探讨了抗菌机理。饲养试验挑选90头、28日龄断奶、平均体重7.0kg左右的杜长大三元杂交断奶仔猪，按要求分成对照组(不添加rPLF、不添加抗生素)、抗生素组(不添加rPLF、添加20mg／kg黄霉素和110mg／kg金霉素)和rPLF组(添加含rPLF的蚕蛹，不添加抗生素)。每个处理组3个重复组，每个重复组10头仔猪(公母各半)。试验猪采用自由采食，自由饮水方式饲喂，预饲期5天，试验期15天。饲养试验结束时，称重，记录耗料，统计试验期内的腹泻率。饲养试验结束后，随机从各组中选出3头试验猪，在自由饮水情况下禁食24小时后屠宰，取结肠内容物进行肠道菌群分析。结果表明： (1)天然的牛乳铁蛋白(BLF)表现出比人乳铁蛋白(HLF)更高的抗菌活性，以大肠杆菌E．coli ATCC 25922为例，牛乳铁蛋白对它的最小抑菌浓度(MIC)是1500μg／ml，人乳铁蛋白的则是2000μg／ml。经过蛋白酶水解的天然乳铁蛋白具有更好的抗菌活性，其中尤以胃蛋白酶的水解效果最佳，同时水解后牛乳铁蛋白的活性也高于水解后人乳铁蛋白的活性。重组猪乳铁蛋白(rPLF)可以明显抑制细菌的生长，但活性低于天然乳铁蛋白纯品，分析可能是因为没有经过纯化的缘故。经过蛋白酶水解后重组猪乳铁蛋白的活性上升，而相应的空白对照材料只有非常微弱的活性，这可以从一个侧面暗示出产物中已经表达有猪乳铁蛋白。 (2)乳铁蛋白肽(Lfcin)的抗菌活性远远高于乳铁蛋白，最高相差达5002004年浙江大学硕士学位论文倍。同以E.coli ATCC 25922为例，乳铁蛋白肤对它的MIC仅为4协g/ml。另外，乳铁蛋白更多的只是表现抑菌效果，而乳铁蛋白肤还表现出明显的杀菌活性，它对君。022灯ee 25922的最小杀菌浓度(MBe)为16林g/ml。时间动态曲线法也发现它的杀菌活性发挥的非常快，在两个小时内就将90%左右的细菌杀死。薄层琼脂糖孔穴扩散法还发现天然乳铁蛋白和抗生素的抑菌圈边缘比较模糊，而Lfcin的抑菌圈非常清晰，圈内外的界线非常明显，整个抑菌圈呈现透亮状态，说明肤所渗透到之处细菌被完全杀死，这暗示出乳铁蛋白肤可能具有不同与前两者的抗菌机理。 (3)体外试验还发现天然乳铁蛋白和乳铁蛋白肤除了对大肠杆菌等致病菌有明显的抗菌效果外，对乳酸杆菌和双歧杆菌等有益菌的抑制活性则非常弱。天然乳铁蛋白肤在试验浓度范围内对两有益菌株均没有表现出抑制活性(MIC>64陀/’ml)，天然乳铁蛋白也仅在最高浓度时对乳酸杆菌有一定的抗菌效果(MIC二5000陀/ml)，对双歧杆菌的生长没有影响。而抗生素尽管能够减少有害菌的生长，但对有益菌生长的抑制作用比乳铁蛋白和乳铁蛋白肤高得多，如对双歧杆菌的MIC两种抗生素都是2陀/ml。这说明乳铁蛋白和乳铁蛋白肤在保护有益菌的繁殖方面效果比抗生素好得多。 (4)铁饱和乳铁蛋白(bolo一LF)的抗菌活性高于天然蛋白，几乎可以完全抑制细菌的生长;天然蛋白的活性高于缺铁乳铁蛋白(apo一LF)，缺铁乳铁蛋白的活性非常微弱，但仍然可以对细菌的生长起到一定的抑制作用，这暗示出乳铁蛋白抗菌作用明显受到铁离子饱和度的影响，饱和度越高抗菌活性越低，同时还可能存在别的机制。 (5)在原子力显微镜下观察到，与乳铁蛋白肤混合后一个小时许多细菌就被杀死，死亡的细菌呈现各种不规则的形态，细胞膜的部分区域发生凹陷，细胞体比较扁平，表明内容物已经溢出，因此判断乳铁蛋白肤可能破坏了细菌的细胞膜，但不能直接观察到膜上是否有缺口。与乳铁蛋白作用后的细菌，菌体由卵圆形或椭圆形转变成细长的杆状，暗示出细菌可能营养不良，推测可能是缺铁造成的。另外还发现，除了生长不好，有一部分细菌的形态也发生了变化，菌体发生弯曲，两端变细，可能是乳铁蛋白直接作用的结果。因此我们判断乳铁蛋白即可2004年浙江大学硕士学位论文以通过结合铁离子也可以直接与细菌作用发挥抗菌活性。 (6)腹泻率方面:rPLF组比对照组降低了66.2%，且差异明显(P<0.05)，添加抗生素组比对照组降低了60.6%，抗生素组和rPLF组之间差异不明显(尸>0 .05)。 (7)肠道菌群方面:与对照组相比，添加rPLF可以减少大肠杆菌生长34.6% (P<0.05)，减少沙门氏菌生长57.4%(尸<0.05)，并且与抗生素组差异都不明显。另外，添加rPLF也可以减少金黄色葡萄球菌的生长，但与对照组相差并不明显。添加rPLF可以增加乳酸菌的数量72.1%(尸<0.05)，增加双歧杆菌的数量143%，差异极显着(尸<0.001)。而添加抗生素对肠道中乳酸菌和双歧杆菌的生长没有明显影响，并且添加rPLF比添加抗生素效果要好(尸<0.05)。这说明添加:PLF可以明显改善断奶仔猪肠道菌群组成比例，减少致病菌的数量增加有益菌的数量，肠道环境的改善必将促进仔猪的健康，减少