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第一部分采用i TRAQ定量蛋白组学技术筛选儿童哮喘血清蛋白标志物及建立诊断模型研究背景:支气管哮喘(bronchial asthma)是以持续的气道炎症、气道高反应性和气道重塑为特征的慢性呼吸道疾病。儿童哮喘发病率逐年增高,约有1/3的患儿可发展成为成人哮喘,及时诊断哮喘、准确评估病情是有效防控儿童哮喘的关键。儿童哮喘不同时期以及病理状态下的蛋白质表达水平的不同,可筛选出与儿童哮喘相关的特异性蛋白,作为预测、诊断、评估儿童哮喘病情及预后的生物标志物。蛋白组学技术的发展为从整体水平分析儿童哮喘相关蛋白提供了技术平台,同位素标记相对和绝对定量标记联合二维液相色谱串联质谱技术(isobaric tags for relative and absolute quantification,two-dimensional liquid chromatography,nanoelectrospray ionization and high resolution tandem mass spectrometry using the hybrid quadrupole time-of-flight platform,i TRAQ-2DLC-MS/MS)将i TRAQ稳定同位素标记、二维液相色谱和串联质谱技术联用的定量蛋白组学技术平台,能够实现疾病相关蛋白的筛选与鉴定。研究方法:收集190例血清样本,其中健康儿童55例,儿童哮喘患者135例。采用i TRAQ-2DLC-MS/MS技术筛选15例儿童哮喘和15例健康儿童血清中的差异蛋白。利用DAVID进行Gene Ontology(GO)功能分析,对差异蛋白进行分子功能,生物过程和细胞成分的功能分类分析和功能富集分析。利用Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)数据库进行相关差异蛋白的信号转导通路分析。利用Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes/Proteins(STRING)软件进行蛋白质-蛋白质相互作用网络分析。应用酶联免疫吸附法在120例儿童哮喘患者和40例健康儿童血清样本中验证差异蛋白。采用受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve,ROC)和多元逻辑回归法(multivariate logistic regression analysis)分析单个蛋白和组合蛋白对儿童哮喘诊断的灵敏度和特异性。采用Biomarker Patterns Software 5.0软件分析并比较儿童哮喘各差异蛋白的权重组合,建立儿童哮喘血清蛋白诊断模型,确定模型的正常阈值,阳性预测值(PPV),Youden指数;并通过10-倍交叉后评估儿童哮喘血清蛋白诊断模型的灵敏度和特异性。研究结果:应用i TRAQ-2DLC-MS/MS技术检测儿童哮喘患者和健康儿童的血清蛋白,共筛选78个差异蛋白(变化倍数>1.2或<0.8),差异蛋白主要具有9种分子功能类型和8种细胞结构,主要参与人体22种重要的生物过程;差异蛋白主要参与53个通路,其中16个差异蛋白参与补体和凝血级联反应通路;ELISA结果显示,儿童哮喘患者血清中载脂蛋白C3(apolipoprotein C-Ⅲ,Apo CⅢ)、载脂蛋白E(apolipoprotein E,Apo E)和血清淀粉样蛋白A(serum amyloid A,SAA)含量均显著高于健康儿童(P<0.05,P<0.001,P<0.001);对Apo CⅢ、Apo E和SAA这3个血清蛋白进行ROC曲线分析,单个血清蛋白的ROC曲线下面积(area under the ROC curve,AUC)分别为0.622、0.763和0.756;多元逻辑回归法计算这3个血清蛋白组合物的AUC为0.850,灵敏度为77.5%,特异性为85.0%。进一步采用决策树建模,构建了由这3个蛋白组成的儿童哮喘血清蛋白诊断模型,该模型对于儿童哮喘诊断的敏感度为79.2%,特异性为92.5%,阳性预测值为96.9%,Youden指数为0.717。结论:(1)通过i TRAQ-2DLC-MS/MS技术和酶联免疫吸附分析法筛选鉴定验证的Apo CⅢ、Apo E和SAA可能为儿童哮喘血清潜在生物标志物,可在临床和功能方面作进一步的验证;(2)筛选的78个儿童哮喘相关的血清差异蛋白主要参与代谢过程、响应刺激、生物调控等生物过程,最主要参与补体和凝血级联反应通路,且差异蛋白间具有紧密的功能联系,结果可为进一步探究儿童哮喘的致病机制奠定基础;(3)采用决策树建模构建的由Apo CⅢ、Apo E和SAA组成的儿童哮喘血清蛋白诊断模型,具有较好的诊断能力,为儿童哮喘诊断提供新方法,可为开发研制儿童哮喘诊断的蛋白芯片试剂盒提供核心数据和技术。第二部分儿童哮喘血清micro RNAs标志物的筛选与诊断模型的构建研究背景:mi RNAs在指导哮喘树突状细胞的分化、调节哮喘T淋巴细胞的增殖、存活、分化和细胞因子的产生中起重要作用,在哮喘的气道炎症、气道重塑等方面扮演重要角色,可作为儿童哮喘预测、诊断、评估的潜在新靶点。高通量测序技术为从整体水平分析儿童哮喘相关mi RNAs提供了技术平台,具有高通量、高精确性、高稳定性等优点。研究方法:收集170例血清样本,其中健康儿童75例,儿童哮喘患者95例。采用Illumina测序技术筛选15例儿童哮喘和15例健康儿童血清中的mi RNAs。应用荧光定量PCR方法在80例儿童哮喘患者和60例健康儿童血清样本中验证差异表达的mi RNAs。通过ROC曲线和多元逻辑回归法分析单个mi RNAs和组合mi RNAs对儿童哮喘诊断的灵敏度和特异性。采用Biomarker Patterns Software 5.0软件分析并比较儿童哮喘各差异mi RNAs的权重组合,建立儿童哮喘血清mi RNAs诊断模型,确定模型的正常阈值,阳性预测值和Youden指数;并通过10-倍交叉后评估儿童哮喘血清mi RNAs诊断模型的灵敏度和特异性。利用Target Scan和mi Randa数据库对特异性mi RNAs进行靶基因预测,同时对特异性mi RNAs靶基因进行GO功能分析、信号转导通路富集分析和Mi RNA-Gene网络分析。研究结果:应用Illumina测序技术检测儿童哮喘患者和健康儿童的血清mi RNAs,共筛选111个差异表达的血清mi RNAs(变化倍数<0.5或变化倍数>1.5)。荧光定量PCR结果显示,儿童哮喘患者血清中hsa-mi R-17-5p、hsa-mi R-18a-5p、hsa-mi R-106a-5p、hsa-mi R-144-3p和hsa-mi R-375均显著高于健康儿童(P<0.0001,P<0.0001,P<0.0001,P<0.0001,P<0.0003),儿童哮喘患者血清中hsa-mi R-19b-3p低于健康儿童(P<0.0293)。对hsa-mi R-17-5p、hsa-mi R-18a-5p、hsa-mi R-19b-3p、hsa-mi R-106a-5p、hsa-mi R-144-3p和hsa-mi R-375进行ROC曲线分析,AUC分别为0.787、0.799、0.608、0.774、0.756和0.678。多元逻辑回归法分析6个血清mi RNAs组合物的AUC为0.924,灵敏度为90.4%,特异性为86.7%。进一步采用决策树建模,构建了由has-mi R-18a-5p、has-mi R-106a-5p、has-mi R-144-3p和has-mi R-375组成的儿童哮喘血清mi RNAs诊断模型,该模型对于儿童哮喘诊断的敏感度为95.00%,特异性为88.33%,阳性预测值为91.57%,Youden指数为0.833。6个儿童哮喘特异性血清mi RNAs主要具有15种分子功能类型和8种细胞结构,主要参与人体25种重要的生物过程;主要参与203个信号通路,共调控13190个靶基因,其中152个靶基因可能与哮喘的发病机制有关,MAP3K1、FRS2两个靶基因被hsa-mi R-19b-3p、hsa-mi R-144-3p、hsa-mi R-18a-5p、hsa-mi R-106a-5p和hsa-mi R-17-5p 5个mi RNAs共同调控。结论:(1)通过Illumina测序技术和荧光定量PCR方法筛选验证的hsa-mi R-17-5p、hsa-mi R-18a-5p、hsa-mi R-19b-3p、hsa-mi R-106a-5p、hsa-mi R-144-3p和hsa-mi R-375可作为儿童哮喘的候选血清mi RNAs标志物,可在临床和功能方面作进一步的验证;(2)采用决策树建模构建的由has-mi R-18a-5p、has-mi R-106a-5p、has-mi R-144-3p和has-mi R-375 4个mi RNAs组成的儿童哮喘血清mi RNAs诊断模型,具有较好的诊断能力,为儿童哮喘诊断提供新方法;(3)筛选的6个差异表达的儿童哮喘血清mi RNAs的相关靶基因主要参与基因表达、蛋白质磷酸化、信号转导等生物过程,主要参与Wnt信号通路、血管平滑肌收缩、T细胞受体信号通路,编码的蛋白主要参与炎症、免疫和转录效率等,结果可为进一步探究mi RNAs在儿童哮喘中的致病机制奠定基础。