论文部分内容阅读
背景和目的:长链非编码RNAs(long noncodingRNAs,lncRNAs)在肿瘤的起始和进展中发挥重要作用,可能成为肿瘤诊断、预后和治疗的分子标记。本研究旨在探讨食管癌(esophageal cancer,ESCA)中差异表达的lncRNA分子、寻找新的预后相关的分子标记,并探讨SLC2A1-AS1在食管鳞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)中的生物学功能及其分子机制。方法:TCGA数据库用来分析ESCA中差异表达的lncRNA、miRNA和mRNA及其相互调控网络及预后相关的lncRNA。q RT-PCR检测ESCC组织和细胞中SLC2A1-AS1、miR-378a-3p和SLC2A1的表达。荧光素酶实验证实转录因子GLI3与SLC2A1-AS1启动子的相互作用。将GLI3 siRNA或pc DNA3.1-GLI3转染ESCC细胞,采用q RT-PCR检测GLI3和SLC2A1-AS1的表达。CCK-8、克隆形成实验、Ed U染色、流式细胞术和Transwell小室检测ESCC细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的变化。Western blot和IHC检测相关蛋白的表达。q RT-PCR和FISH分析SLC2A1-AS1在ESCC细胞中的定位,双荧光素酶报告实验与Ago2-RIP分析SLC2A1-AS1或SLC2A1与miR-378a-3p的结合。建立EC9706的裸鼠移植瘤模型,采用pc DNA3.1-SLC2A1-AS1和化学修饰的SLC2A1-AS1 siRNA进行治疗,每周测量肿瘤体积评估治疗效果。统计学分析:数据采用Graph Pad Prism8.0软件进行处理,两组之间比较采用t检验,多个样本的比较采用单因素方差分析(One way ANOVA),P<0.05表示具有统计学意义。结果:1.ESCA中分别具有145个、112个和2000个差异表达的lncRNAs、miRNAs和mRNAs。2.ceRNA网络中共有301个节点,包括40个lncRNAs、28个miRNAs和233个mRNAs,共产生677个关联。3.WDFY3-AS2、CASC8、UGDH-AS1、RAP2C-AS1、AC007128.1、AC016205.1、AC092803.2和AC079949.2与ESCA病人的总的生存率密切相关。4.ESCC组织中SLC2A1-AS1的表达水平显著高于正常组织(P<0.0001),其高表达均与ESCC病人的TNM分期、淋巴结转移及不良预后密切相关(P<0.05)。GLI3能结合SLC2A1-AS1的启动子区,GLI3上调显著促进SLC2A1-AS1的转录,而GLI3下调显著抑制SLC2A1-AS1的转录。SLC2A1-AS1下调显著抑制ESCC细胞中GLI3的表达,而SLC2A1-AS1上调显著促进ESCC细胞中GLI3的表达。5.SLC2A1-AS1下调抑制ESCC细胞的增殖和侵袭以及诱导细胞凋亡,增加E-cadherin的表达,降低N-cadherin和Vimentin的表达水平,引起葡萄糖消耗和乳酸产量下降以及糖酵解相关蛋白SLC2A1、HK2、PFKM、PKM和LDHA表达下调;而SLC2A1-AS1表达上调呈现相反的结果。6.q RT-PCR和FISH结果表明,SLC2A1-AS1主要定位于ESCC细胞的胞质中。双荧光素酶报告实验与Ago2-RIP结果表明,SLC2A1-AS1在ESCC细胞中与miR-378a-3p相结合,SLC2A1-AS1下调显著增加ESCC细胞中miR-378a-3p的表达水平,而SLC2A1-AS1上调显著抑制miR-378a-3p的表达水平。7.miR-378a-3p在ESCC组织和细胞中呈低表达,而SLC2A1在ESCC组织和细胞中呈现高表达,二者表达均与ESCC病人的TNM分期和淋巴结转移密切相关。SLC2A1是ESCC细胞中miR-378a-3p直接作用靶点,miR-378a-3p模拟物显著降低SLC2A1的表达,而miR-378a-3p抑制剂显著促进SLC2A1的表达。8.SLC2A1-AS1和SLC2A1的过表达逆转miR-378a-3p模拟物介导的增殖和侵袭能力的降低、凋亡的增加以及糖酵解相关蛋白HK2、PFKM、PKM和LDHA表达的下调,而SLC2A1-AS1和SLC2A1下调出现相反的效应。9.体内动物实验结果表明,SLC2A1-AS1表达下调显著抑制EC9706裸鼠移植瘤的生长,下调SLC2A1-AS1的表达和上调miR-378a-3p的表达,并引发SLC2A1、HK2、PFKM、PKM和LDHA表达下调,而SLC2A1-AS1过表达在EC9706裸鼠移植瘤中出现相反的效果。结论:1.ESCA中具有许多差异表达的lncRNAs分子,许多lncRNAs与ESCA病人预后密切相关。2.GLI3的高表达可能是ESCC细胞中SLC2A1-AS1高表达的因素,GLI3与SLC2A1-AS1可能在ESCC中形成反馈调节环。3.SLC2A1-AS1在ESCC中高表达,其表达下调通过抑制糖酵解相关蛋白表达抑制肿瘤的增殖和侵袭,诱导ESCC细胞凋亡,其表达上调通过促进糖酵解相关蛋白表达促进肿瘤的增殖和侵袭,抑制ESCC细胞凋亡。4.SLC2A1-AS1通过抑制ESCC细胞中miR-378a-3p的表达水平从而上调SLC2A1及糖酵解相关蛋白的表达,促进ESCC细胞的糖酵解,加速ESCC进展。