由卵菌致病疫霉Phytophthora infestans引起的晚疫病是世界上马铃薯生产中最为严重的病害。晚疫病病原菌P.infestans基因组含有几百个编码具有保守“RXLR”结构域的效应子基因(效应蛋白,effector)。晚疫病菌分泌并转运这些效应子到寄主细胞内侵染植物并抑制植物的免疫应答反应。为应对病原菌的侵染,植物进化出一套免疫系统来感知并抵御病原而激活自身防卫反应,其中包括病原相关分子模式(PAMPs,Pathogen associated molecular patterns)引起的免疫反应(PTI,PAMPs-triggered immunity)和病原菌效应蛋白引起的免疫反应(ETI,Effector-triggered immunity)。植物PTI和ETI免疫反应介导转录水平基因的表达和病程相关蛋白合成的调控,受翻译后水平的调控(post-translational modifications,PTMs)。翻译后水平的修饰是蛋白稳定的调节中心,能够快速的改变蛋白的活性,使得植物细胞能够灵活地利用这些蛋白应对病原菌的侵染。其中泛素化是十分重要的转录后水平的调控途径。越来越多的研究证明植物PTI和ETI免疫反应的激活需要E3泛素连接酶介导的26S蛋白降解途径来进行免疫的正向调控或负向调控。本研究探究了三个相关的E3泛素连接酶在马铃薯抗性免疫应答中的作用:PUB17和Ubox-kinase(UBK)为正调控因子,POB1为负调控因子。PUB17和UBK属于Ubox类E3泛素连接酶,而POB1是包含BTB/BACK保守结构域的E3泛素连接酶。Chapter3中研究证实了马铃薯PUB17作用于细胞核中正调控晚疫病P.infestans介导的特异的信号传导。体外纯化StPUB17具有E3泛素连接酶的活性。在马铃薯或本氏烟(Nicotiana benthamiana)上沉默PUB17导致晚疫病抗性下降,表明PUB17参与植物的基础免疫反应。在马铃薯、普通烟草(Nicotiana tabacum)或本氏烟中证明PUB17是参与抗性基因Cf4与其相应的无毒基因Avr4介导的细胞死亡(PCD)的信号传导途径;但是PUB17不参与晚疫病PAMP INF1和NBS-LRR抗性基因R3a与无毒基因Avr3a介导的细胞死亡。因此,PUB17并不是广泛参与病原菌介导的细胞死亡的免疫反应过程,而是参与特异细胞死亡途径信号传导,预示晚疫病菌中存在未知的效应子引起了依赖于PUB17的植物免疫反应途径。同时证明pub17是pampflg22激发的基础免疫反应所必须的。沉默pub17抑制flg22诱导的pti抗病相关基因的表达。但是pub17不参与pampinf1介导的信号途径,因此,pub17并不介导所有的pti免疫信号途径。目前还没有pubse3泛素连接酶正调控pti免疫反应的报道。本研究首次证实pub17正调控pti免疫反应。进一步研究表明pub17定位于细胞核中。stpub17突变体(stpub17v314i,v316imutant)也定位于细胞核中,能够抑制cf4介导的细胞死亡,并且促进晚疫病的侵染,表现出显性负调控的作用。通过出核信号肽(nuclearexportsignal,nes)将stpub17v314i,v316imutant运出细胞核,会抑制显性负调控作用。因此,细胞核定位是pub17对免疫反应的调控功能必须的,同时也预示着pub17的作用底物也在细胞核中。鉴别pub17在免疫信号传导途径中的作用底物是进一步研究pub17如何调节植物的免疫反应的关键。chapter4中,酵母双杂和免疫共沉淀证明pub17与pob1互作。研究发现在烟草上沉默pob1能够抑制病原菌的扩展,增强晚疫病的抗性;而瞬时超量表达pob1促进晚疫病的侵染,并且能够抑制cf4/avr4介导的细胞死亡,因此pob1表现为负调控植物基础免疫和细胞死亡反应。同时证明pob1定位于细胞核中,通过nes信号使pob1输出核外会导致pob1失去抑制植物的基础免疫反应和细胞死亡的能力。证明细胞核定位是pob1调控免疫反应必须的。在本氏烟中共表达yc-taggedpub17和yn-taggedpob1,yfp荧光聚焦于在细胞核中,证明pub17和pob1在细胞核中互作。并且只有当处理蛋白抑制子mg132时才能观察到细胞核的荧光,表明pub17和pob1蛋白的互作引起其中一个或两个蛋白的降解。共表达mrfp-pob1和gfp-pub17时,细胞核表现出很强的mrfp-pob1的红色荧光,表明pob1有较高的表达量;但是与stpub17单独存在时,gfp-stpub17的绿色荧光显著减弱,表明pob1对pub17的稳定性有影响。同时蛋白杂交印迹表明共表达pob1与pub17时,pub17消失;处理mg132时,pub17稳定存在表明pob1降解pub17可能依赖于26s蛋白降解途径;但是nes-pob1出细胞核后,pub17稳定存在。表明pob1在细胞核中通过降解pub17来负调控免疫反应。在chapter5中,研究了另外一个e3泛素连接酶ubk被晚疫病效应子靶标调节植物免疫反应的过程。研究表明在马铃薯中稳定超量表达p.infestansrxlr效应子PiSFI3能够促进晚疫病的扩展,并且能够抑制flg22介导的PTI抗病相关标志基因的表达,表明PiSFI3在马铃薯中抑制早期的PTI免疫反应。酵母双杂证明PiSFI3与UBK互作,都定位于细胞核中,预示其互作在细胞核内。与PUB17相似,在烟草中VIGS沉默UBK或者在马铃薯上干涉(RNAi)UBK,都能够促进晚疫病的侵染,并且抑制flg22介导的PTI抗性相关基因的表达,表明UBK参与flg22介导的基础免疫反应(PTI)过程,UBK正调控植物免疫反应。与PUB17不同的是,UBK不参与Cf4介导的细胞死亡,也不参与INF1引起的细胞死亡反应。同时,靶向UBK的晚疫病菌效应子PiSFI3也不抑制CF4或INF介导的细胞死亡。由晚疫病菌PAMP INF1、叶霉病效应子Avr4以及细菌的PAMP flg22引起的三条植物免疫应答信号通路依赖于不同的蛋白激酶(MAPK)介导的免疫信号传导。本研究表明E3泛素连接酶PUB17和UBK正调控Flg22介导的抗病信号传导;同时PUB17特异正调控Cf4/Avr4介导的细胞死亡信号传导,而POB1负调控Cf4/Avr4介导的细胞死亡信号传导,UBK不参与Cf4/Avr4和INF1介导的细胞死亡信号传导。这3个E3泛素连接酶调控的信号传导途径既有相同部分,又相互区别,表明它们作用于不同的底物来调控不同的免疫信号途径。本研究表明E3泛素连接酶不仅被植物自身利用以抵御病原菌的侵染,同时E3泛素连接酶也是病原菌效应蛋白的靶标,病原菌通过操纵或抑制它们的活性来促进自身的侵染。本研究为深入开展泛素系统在马铃薯抗病免疫应答中的作用研究奠定了坚实基础。后续研究可以从筛选和确认这些E3泛素连接酶的靶标蛋白、分析它们参与的信号传导通路入手,进一步深入系统解析泛素系统介导植物的免疫反应的机制,为马铃薯晚疫病抗性提供新思路与方法。