论文部分内容阅读
目的:慢性肾小管间质纤维化是影响慢性肾脏病(CKD)患者肾脏远期预后的重要因素。Versican(VCAN)是一种大分子的细胞外基质蛋白多糖,其表达水平与肝硬化、肺纤维化等器官组织慢性病理损伤程度相关。CKD患者中VCAN表达增加与慢性肾小管间质损伤之间的关系目前尚不明确。本研究旨在应用FSGS患者的肾活检组织,体外培养的肾小管上皮细胞和肾脏成纤维细胞,以及多种小鼠模型,探讨CKD患者肾小管间质组织中VCAN V1水平与肾小管间质纤维化之间的关系,阐明肾小管间质中VCAN V1沉积的机制和效应。方法:本研究共分为四部分,第一部分,FSGS作为CKD代表性疾病纳入研究,收集8例正常对照和8例FSGS患者肾小管间质组织进行转录组基因芯片分析,将差异性表达的基因与肾小管间质纤维化评分进行相关性分析,筛选出差异性表达基因。选取20例正常对照和20例FSGS患者激光微分离肾小管间质组织,RTPCR对差异性表达基因VCAN进行验证。第二部分,用VCAN V1刺激肾脏成纤维细胞,并同时给予si-CD44、CD44mAb阻断等干预;体内实验利用质粒注射转染方法建立VCAN V1过表达小鼠模型,并给予CD44 mAb干预。BrdU-ELISA法测定成纤维细胞的增殖,Western blot检测Col I、VCAN V1、p-Smad3、Smad3水平,蛋白质免疫共沉淀检测VCAN和CD44的结合水平,Masson染色检测肾小管间质纤维化程度。第三部分,肾小管上皮细胞用血清和C3a刺激,并同时给予SB290157(C3aR阻断剂)、MK2206(AKT阻断剂)、β-catenin转染或敲低等干预;体内实验应用野生型和C3aR-/-型小鼠建立ADR肾病模型。RT-PCR检测VCAN各亚型表达,免疫荧光检测C3a和C3aR表达,ELISA检测血和尿C3a水平,Western blot检测p-Akt、Akt和细胞核β-catenin水平,ChIP和荧光素酶报告实验检测β-catenin与VCAN启动子结合,Masson染色检测肾小管间质纤维化程度。第四部分,肾小管细胞用血清和suPAR刺激,并给予anti-uPAR、C3a、siITGB6、si-Rac1等干预;体内实验利用胶囊渗透压泵控释suPAR联合鼠尾静脉注射ADR建立肾病小鼠模型。RT-PCR检测VCAN各亚型表达,ELISA、免疫组化染色检测血、尿和肾组织suPAR水平,免疫荧光检测uPAR/ITGB6和SRp40/Rac1表达,Co-IP检测uPAR/ITGB6、Rac1/SRp40结合水平,RIP检测SRp40、Rac1、U2AF1与VCAN pre-mRNA结合水平,RAP检测VCAN pre-mRNA内含子6/8结合水平。结果:第一部分实验结果显示:通过分析FSGS肾小管间质转录组基因芯片结果发现495个差异性表达的基因。将差异性表达基因与肾小管间质纤维化评分进行相关性分析,VCAN水平与肾小管间质纤维化评分相关性最明显。独立样本证实了FSGS肾小管间质中差异性表达的VCAN亚型是VCAN V1,且VCAN V1与肾小管间质纤维化评分具有相关性。第二部分实验结果显示:与正常组相比,VCAN V1过表达肾小管上皮细胞上清液或提取纯化的VCAN V1刺激成纤维细胞,可以导致成纤维细胞活化和Col I产生增加,VCAN V0作用较弱,而VCAN V3没有这种作用。CD44 mAb可以阻断VCAN V1和CD44之间的结合,缓解VCAN V1刺激所致的Smad3磷酸化、成纤维细胞活化和Col I产生。体内研究表明,CD44 mAb阻断可以降低VCAN V1过表达小鼠模型中VCAN与CD44结合水平、Smad3磷酸化程度,减少成纤维细胞的积聚和Col I的沉积,缓解肾小管间质纤维化程度。第三部分研究结果显示:血清或C3a刺激肾小管上皮细胞导致总VCAN表达上调,VCAN亚型分析发现患者血清刺激导致VCAN V1特异性增高,而C3a导致VCAN所有亚型均升高。C3a刺激可以导致AKT磷酸化和β-catenin入核增加,ChIP和荧光素酶报告实验证实β-catenin通过结合在VCAN启动子上促进基因转录。体内研究表明,C3aR敲除可以抑制C3a在ADR小鼠肾小管部位的沉积,降低AKT磷酸化和β-catenin入核水平,减少肾小管间质中VCAN表达,进而缓解肾小管间质纤维化。第四部分研究结果显示:血清刺激肾小管上皮细胞时,suPAR可以与ITGB6相互结合,活化下游Rac1影响VCAN可变剪接。Rac1在血清刺激条件下通过SRp40介导与VCAN pre-mRNA结合,诱导VCAN外显子7的跳跃性剪接。另外,患者血清刺激肾小管上皮细胞时,Rac1与VCAN pre-mRNA相互结合可以干扰内含子6和内含子8的相互作用,抑制VCAN V3亚型形成。体内研究表明,与ADR肾病小鼠模型相比,suPAR联合ADR共刺激小鼠模型中尿液和肾组织suPAR水平明显增加,Rac1活性及其与SRp40结合水平明显增高,VCAN V1亚型特异性增高。应用suPAR联合ADR共注射小鼠可以加重肾小管间质组织中成纤维细胞的聚集和Col I沉积,导致小鼠血肌酐明显增加,肾小管间质纤维化损伤程度更加严重。结论:1.CKD患者肾小管间质组织中VCAN V1水平明显增加,且与肾小管间质纤维化评分相关。2.肾小管上皮细胞产生的VCAN V1可以诱导成纤维细胞增殖和Col I产生,CD44阻断可以缓解VCAN V1刺激所致的肾小管间质纤维化。3.C3a通过激活AKT/β-catenin通路诱导VCAN转录水平上调。4.suPAR通过激活β6-integrin/Rac1通路影响VCAN pre-mRNA可变剪接。