1.研究背景糖尿病(DM)是一组由遗传和环境等多因素共同引起的以糖代谢紊乱为主要表现的临床综合征。胰岛素缺乏和胰岛素作用障碍单独或同时引起糖类、脂肪、蛋白质、水和电解质等的代谢紊乱,临床以慢性高血糖为主要特征,急性并发症有酮症酸中毒、高渗性高血糖状态和乳酸性酸中毒。糖尿病可并发多种慢性并发症,导致器官功能障碍和衰竭,甚至致残和致死,给社会带来沉重负担,糖尿病的发病率不断升高,预计到2025年全世界糖尿病患者将增至3亿。尤其发展中国家发病率迅速增加,我国糖尿病患者人数仅次于印度,目前已达9000多万人次。糖尿病的慢性并发症多且较为严重,随着病程的延长,主要表现为冠心病、脑血管和外周血管病变、肾病和视网膜病变等。2型糖尿病占DM发病率的90%,2型DM的基本特征是胰岛素分泌不足和胰岛素抵抗,后者与肥胖和代谢综合征有关。糖尿病前期,即空腹血糖受损和糖耐量受损状态,占所有人群的10%以上,临床上主要表现为餐后血糖升高,早期发现、早期干预,即降低餐后高血糖,可以逆转这种状态,防止糖尿病的发生发展。根据我国在1998年和2006年的两次横断面调查表明,有90%和73%的2型糖尿病患者糖化血红蛋白(HbAlc)没有达到理想的控制目标。虽然传统西药控制血糖和血脂效果明显,但往往产生许多副作用,且不能治愈疾病,所以,长期、有效的预防和控制相关慢性疾病是延迟并发症发生,提高患者生命质量和生活质量的重要措施。对糖耐量异常、糖尿病早期病人以及血脂升高的早期病人,降糖、降脂类保健食品将起到积极的预防保健作用。有鉴于此,本项目组提出了利用天然桃胶开发辅助降糖和降脂保健食品的课题。桃胶(peach resin)是桃树(蔷薇科植物)的树干受机械损伤(如虫咬、切伤等)或致病后分泌出来的胶质半透明物质。其主要成分是多糖、蛋白质等,其他物质含量极少。其多糖由半乳糖、阿拉伯糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸等成分组成。丁婷等等前期研究证实喂食原桃胶能够降低糖尿病模型大鼠的血糖,且呈一定的量效关系。由于桃胶多糖是大分子的有机化合物,不能被人体上消化道的消化酶消化,故其发挥作用主要是在肠道内。洪郁之等认为原桃胶延缓肠道对糖的吸收,最终导致餐后血糖下降,血中胰岛素水平下降。本课题组成员王飞等研究表明,桃胶多糖的降糖机制之一是桃胶多糖不能被人体肠道的主要消化酶消化；并且桃胶多糖可以抑制体内的淀粉酶和麦芽糖酶活性,延缓肠道内碳水化合物的消化和吸收,达到降血糖的目的；在四氧嘧啶诱导的糖尿病大鼠模型上,发现三种不同分子量的桃胶多糖均能显著降低糖尿病大鼠的空腹和餐后2h血糖水平,三种分子量的桃胶多糖降糖效果比较无显著差异,降糖效果与阿卡波糖相比较无显著差异。多糖是一类由十个及以上单糖组成的复杂的大分子化合物,在自然界中来源甚广,有细菌多糖、植物多糖、真菌多糖和动物多糖等。近十多年来,对多糖降血糖的研究越来越多,多糖降血糖的机制主要集中在以下几个方面：①改善胰岛细胞形态和功能,促进胰岛素分泌：②提高胰岛素敏感性；③改善糖代谢,促进肝脏、肌肉等外周组织和靶器官对糖的利用；④调节自身免疫,清除自由基,防止脂质过氧化；⑤改善糖代谢相关酶活性；⑥抑制a葡萄糖苷酶活性,延缓葡萄糖吸收。然而,由于除淀粉外的多糖本身的分子质量以及结构,决定了其不能被人体消化道内的消化酶所分解,也就无法完整的进入到血液中发挥降血糖的功效,其发挥降血糖的作用在肠道内。由此推断,关于动物口服多糖直接改善胰腺功能、改变糖利用等的推论观点并不能解释非淀粉类多糖影响体内代谢的真正机制,这也是目前中药领域关于非淀粉类多糖降糖机制值得探讨的一个问题。从分子结构上分析,单糖与多糖相似,单糖的吸收是主动运转的形式,作用于肠道的多糖类物质是否能够通过竞争抑制而影响单糖的主动转运,影响肠道对于葡萄糖的吸收,达到降低血糖作用,可能是多糖降低血糖的另外机制之一。检索国内外文献未见报道。Caco-2(human colon adenocarcinoma cell lines)细胞系是目前研究药物肠道吸收的主要模型之一,能够表达营养物质吸收的主要载体和相关酶类,包括葡萄糖吸收的主要载体SGLT-1,已成为预测药物在人体小肠吸收和药物载体吸收研究的标准体外筛选工具。本研究使用caco-2单层细胞模型模拟肠道上皮SGLT-1吸收葡萄糖的过程,并采用桃胶多糖干预的方法,探讨桃胶多糖是否存在抑制葡萄糖吸收而具有降低血糖的作用。桃胶多糖肠道内的降糖机制是否能够通过竞争性抑制SGLT-1对葡萄糖的主动转运、是否能够刺激肠促胰岛素分泌等达到降血糖效果,以及是否能够在肠道内抑制脂类物质的吸收以降低血脂等其他作用还有待进一步研究。2.研究方法2.1.多糖的提取、分离将购买的新鲜桃胶去杂、漂洗后进行冷冻干燥,干燥的桃胶经超微粉碎后,得到原桃胶粉。取上述原桃胶粉加入蒸馏水,90℃水浴锅,水浴4h后搅拌提取,重复一次。合并两次浸提液,4000r/分离心20分钟得上清液。将上清液于60℃真空浓缩至原体积1/5。脱蛋白法一：将氯仿和丁醇溶液按v：v=5：1的比例加到浓缩液中,混合物剧烈振摇5min后静置萃取,分去水层和溶液层交界处的变性蛋白质,得脱蛋白糖液,反复多次至水与溶液层交界处无明显蛋白沉淀为止。采用梯度醇沉法在上述脱蛋白糖液加入无水乙醇至80%沉淀,重复多次加入,直至没有产生沉淀为止,冷冻干燥,得到乙醇浓度沉淀的桃胶多糖。2.2.一般细胞培养2.3.细胞毒性的测定(MTT实验)2.4. caco-2细胞模型的建立[15]当细胞传至第20～30代时,取处于对数生长期生长良好的细胞,弃去培养液,HBSS液冲洗3次后,用胰酶消化,适量完全培养液终止消化,转移到15ml离心管中,并置于800rpm的离心机中离心3-5min。弃去上清液,并加入适量完全培养液,用细胞计数板于倒置显微镜下进行计数,调整细胞悬液浓度至1×105～5×105个/mL。按照每孔一定的细胞浓度接种于Transwell多聚碳酸酯膜培养板上(corning,3413)。第一周隔天换液,一周后每天换液,换液时注意不要吸附到贴于膜上的细胞,以保证细胞完全贴壁以形成完整的膜结构。培养至21～23天。2.5.caco-2细胞模型的鉴定细胞接种于Transwell板上后,于培养第1、3、6、9、11、15、19、22天时用细胞电阻仪测定跨膜电阻值(TEER),以了解细胞单层完整性及紧密性形成过程。2.6.桃胶多糖对Caco-2细胞吸收葡萄糖影响的研究方法取经检测合格的caco-2细胞单层模型,首先吸净Transwell系统中AP侧以及BL侧的培养液,吸净后用适量HBSS液(PH=7.4)冲洗两侧各2次,第二次冲洗时放入37℃的CO2培养箱中平衡20min。根据实验分组称取葡萄糖和桃胶多糖适量,并用HBSS液溶解混匀,并过滤消毒,使用之前先预热至37℃。加药前用MTT(噻唑蓝)对0.125～1ug/ml桃胶多糖进行细胞毒性考察,实验未见桃胶多糖对细胞有毒性。把含有葡萄糖和(或)桃胶多糖的HBSS液0.1ml加入到AP侧,BL侧加入0.7ml作为接收液,放入培养箱中孵育。期间吸取AP侧液体适量,测定葡萄糖的剩余量。按照吸取的量,重新补齐相等的液体量入AP侧小室中。2.6.1一定浓度桃胶多糖对不同浓度葡萄糖吸收的影响的研究方法在Caco-2细胞单层模型上,不同浓度的葡萄糖HBSS溶液(0,10,15,20,25mmol/L)并各加入1ug/ml桃胶多糖溶液为实验组,对照组则不加入桃胶多糖,作用不同时间后(0,30,60,90,120min),用葡萄糖[GOPOD法]检测试剂盒检测葡萄糖在液体中的剩余量,从而推断桃胶多糖影响下不同浓度葡萄糖与Caco-2细胞结合情况。2.6.2.不同浓度的桃胶多糖对一定浓度葡萄糖吸收量影响的研究方法为进一步探讨不同浓度的桃胶多糖对于相同葡萄糖浓度的影响是否有差异,将桃胶多糖分成1,0.5,0.25,0.125ug/ml四个浓度组,每个组样本量5个,分别加入20mmol/L葡萄糖HBSS溶液,以空白的20mmol/L葡萄糖组为对照,余方法如前。2.7.统计学方法各组数据以X±S表示,采用SPSS13.0统计学软件进行数据分析。MTT实验组间比较使用单因素方差分析(One-Way ANOVA),其余采用单个重复测量因素的方差分析方法进行统计3.结果3.1.桃胶多糖的提取、分离通过采用水浴锅浸提、Sevage法脱蛋白(或木瓜蛋白酶脱蛋白)、乙醇沉淀的方法得到相对较纯的桃胶多糖,所得桃胶多糖经葡聚糖凝胶层析柱纯化,研磨粉碎后,状态为灰褐色固体粉末,得率为50%左右。3.2caco-2细胞培养形态体外培养的caco-2细胞为贴壁生长细胞。在培养瓶中时,单个细胞生长呈扁平状多角形,胞体中央可见圆形细胞核,并逐渐生长为膜状单层细胞,细胞之间紧密连接,细胞形态变为整齐方形或圆形,整体呈“铺路石样”形态。将20-30代培育的细胞接种于Transwell多聚碳酸酯膜培养孔上后,经过约21天的培养,细胞分化形成微绒毛及连接复合体,建立更紧密的连接及良好的刷状缘后,即成为可靠的单层细胞吸收模型。3.3细胞毒性试验结果用HBSS液体配置的桃胶多糖溶液,浓度分别为(4,2,1,0.5,0.25,0.125ug/ml),加入到96孔板中行MTT试验,以研究其对caco-2细胞的毒性作用。结果显示,桃胶多糖溶液浓度在0.125～1ug/ml时,与阴性对照组之间比较无显著性差异(P>0.05,n=6),即0.125～1ug/ml桃胶多糖对caco-2细胞无明显毒性作用。3.4caco-2细胞单层模型验证细胞接种于Transwell板上后,用细胞电阻仪测定跨膜电阻值(TEER),可见TEER值随培养天数增加而上升,21天后TEER值均大于600以上,符合实验要求。3.5一定浓度桃胶多糖对不同浓度葡萄糖吸收的影响实验组分别加入1ug/ml桃胶多糖后,对照组不加入桃胶多糖,葡萄糖浓度为10,15,20,25mmol/L,分别于30,60,90,120min时检测葡萄糖值。10mmol/L葡萄糖加1ug/ml桃胶多糖组与对照组相比,葡萄糖的吸收有显著差异(P=0.000);15mmol/L葡萄糖加1ug/ml桃胶多糖组与对照组相比,葡萄糖的吸收有显著差异(P=0.000)；20mmol/L葡萄糖加1ug/ml桃胶多糖组与对照组相比,葡萄糖的吸收有显著差异(P=0.001)：20mmol/L葡萄糖加1ug/ml桃胶多糖组与对照组相比,葡萄糖的吸收有显著差异(P=0.001<0.05)；25mmol/L葡萄糖加1ug/ml桃胶多糖组与对照组相比,葡萄糖的吸收有显著差异(P=0.009)。由此可知,即桃胶多糖对不同浓度的葡萄糖吸收均有抑制作用。对各实验组葡萄糖吸收量随时间变化的结果进行两两比较,结果显示,不同实验组之间葡萄糖吸收均有显著差异(P=0.000),说明实验组葡萄糖浓度越小,桃胶多糖抑制葡萄糖吸收的效果越好。Mauchly球形检验统计量W=0.507,P=0.076,不拒绝球形假设,应用单变量检验方法时无需ε校正。3.6不同浓度的桃胶多糖对一定浓度葡萄糖吸收量的影响与对照组相比,不同浓度的桃胶多糖溶液(0.5,0.25,0.125ug/m1)对于一定浓度的葡萄糖(20mmol/L)吸收均有抑制效果(P<0.05),结果见表2。结果显示,不同桃胶多糖浓度组葡萄糖吸收量随时间变化的关系见图2,说明桃胶多糖浓度越高,葡萄糖的吸收量越少,抑制葡萄糖吸收的效果越好(P<0.05)。Mauchly球形检验统计量W=0.256,P=0.001,拒绝球形假设,Greenhouse-Geisser校正,不同实验组的4个时间点葡萄糖吸收有显著性差异(F=934.31,P=0.000)。4.研究结论1.由于桃胶多糖是由十个以上单糖通过糖苷键紧密结合形成的大分子化合物,桃胶多糖不能被人体上消化道消化吸收,故桃胶多糖发挥降低血糖的作用部位在肠道内而非血液。2.体外建立的caco-2模型,排除了肠道消化酶、肠道基底侧GLUT-2和肠道菌群等因素对多糖分解和单糖吸收的影响,通过影响上消化道刷状缘侧葡萄糖吸收的的转运蛋白SGLT-1的结果,提示桃胶多糖可能通过结合葡萄糖吸收的位点,从而延缓葡萄糖的吸收,达到降低餐后血糖的作用。3.桃胶多糖抑制葡萄糖吸收的效果表现出浓度依赖性,由此可以推断桃胶多糖和葡萄糖之间可能存在竞争性抑制吸收的作用。4.桃胶多糖对于caco-2细胞本身不具备明显毒性。其价格低廉、分布广、无毒性、不被吸收、降低餐后血糖等优良特性为进一步开发以其为基础的保健食品药品提供了良好的前景。