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目的：以广泛性焦虑(generalized anxiety disease,GAD)动物为研究载体,观察以丹栀逍遥散为代表方剂的疏肝清热健脾法对GAD大鼠行为学、Papez环路内神经营养因子及受体、海马齿状回区域内神经干细胞的增殖和分化水平的干预作用,以进一步揭示GAD的发病机制,以及丹栀逍遥散对GAD大鼠神经修复与再生的作用途径,完善疏肝清热健脾法治疗GAD的理论学说。方法：雄性Wistar大鼠经open-field test评分后,随机分为正常组、模型组、中药治疗组和西药对照组,每组10只大鼠。不确定空瓶刺激法制备GAD大鼠模型,共21d,第15d开始进行药物干预,模型组、中药组和西药组分别给予蒸馏水、丹栀逍遥散和盐酸丁螺环酮水溶液灌胃,正常组给予同等剂量的蒸馏水。分别在造模的第7d、14d和21d进行旷场实验和高架十字迷宫行为学测试。取出脑组织后,免疫组化法检测大鼠海马CA1、CA2、CA3、DG区、杏仁核和丘脑前核内的BDNF及受体TrkB、bFGF及受体bFGFR和NGF的表达水平。免疫荧光法检测海马齿状回内Brdu、Brdu/Nestin、Brdu/NeuN和Brdu/GFAP阳性细胞数量。结果：1一般情况观察1.1形态、运动与精神状态21d造模结束后,模型组大鼠较正常组体型瘦削,皮毛枯萎无光,神态慵懒,梳理毛发、寻觅探查等自主活动较少,饮食不积极,较易被激惹,出现攻击、撕咬水瓶等行为；经过7d的药物干预后,中药组和西药组的大鼠总体状态较模型组有所改善,但仍不及正常组。1.2体重在造模第7d、14d和21d,模型组大鼠体重明显低于正常组(P<0.01)；药物干预7d后,第21d中药组、西药组的大鼠体重较模型组都有明显的升高(P<0.01)。2行为学观察2.1旷场试验(OFT)第7d、14d和21d,模型组的水平得分(HS)和垂直得分(VS)均较正常组有明显的降低(P<0.05、P<0.01)；经过药物干预7d后,第21d中药组和西药组的HS、VS与模型组相比都有明显的升高(P<0.01、P<0.05)。2.2高架十字迷宫试验(EPM)第7d、14d和21d,模型组的OE/TE、OT/TT值均较正常组有明显的下降(P<0.01、P<0.05)；药物干预7d后,第21d中药组OE/TE、OT/TT较模型组升高(P<0.05),西药组与模型组比较无差异(P>0.05)。3 Papez环路内神经营养因子(NTFs)及受体含量检测3.1脑源性神经营养因子(BDNF)及受体TrkB①海马：与正常组相比,模型组BDNF、TrkB阳性表达部位的IOD值在海马的CA1、 CA2、CA3及DG区都有明显的下降(P<0.01或P<0.05)；与模型组相比,中药组的IOD值在四个分区都有较为明显的增加(P<0.05或P<0.01),西药组BDNF的IOD值在CA3区有明显增加(P<0.05),TrkB的IOD值在CA3和DG区有明显增加(P<0.05)。②杏仁核、丘脑前核：与正常组相比,模型组BDNF、TrkB蛋白IOD值在杏仁核区有明显的下降(P<0.01或P<0.05)；与模型组相比,中药组和西药组的IOD值均有明显的增加(P<0.01)。四组大鼠在丘脑前核区的BDNF、TrkB蛋白IOD值相比无明显差异(P>0.05)。3.2碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)及受体bFGFR①海马：与正常组相比,模型组bFGF、bFGFR蛋白阳性表达部位的IOD值在海马CA1、CA2、CA3及DG区都有明显的增加(P<0.05或P<0.01)；与模型组相比,中药组的IOD值在四个分区都有较为明显的增加(P<0.05或P<0.01),西药组IOD值与模型组比无明显差异(P>0.05)。②杏仁核、丘脑前核：与正常组相比,模型组bFGF、bFGFR蛋白阳性表达部位的IOD值在杏仁核有明显的下降(P<0.05)；与模型组相比,中药组的IOD值在杏仁核区有较为明显的增加(P<0.05)。四组大鼠bFGF、bFGFR蛋白IOD值在丘脑前核区相比无明显差异(P>0.05)。3.3神经生长因子(NGF)①海马：与正常组相比,模型组NGF蛋白阳性表达部位的IOD值在海马CA1、 CA2、CA3及DG区都有明显的下降(P<0.05或P<0.01)；与模型组相比,中药组、西药组的IOD值在四个分区都有较为明显的增加(P<0.01或P<0.05)。②杏仁核、丘脑前核：与正常组相比,模型组NGF蛋白的IOD值在杏仁核区有明显的下降(P<0.01)；与模型组相比,中药组和西药组的IOD值均有明显的增加(P<0.01)。四组大鼠在丘脑前核区的NGF蛋白IOD值相比无明显差异(P>0.05)。4海马齿状回神经干细胞(NSCs)增殖、分化水平检测4.1 Brdu单标记阳性细胞数与正常组相比,模型组海马内的Brdu单标记阳性细胞数有明显的增加(P<0.01)；与模型组相比,中药组的Brdu阳性细胞数有较为明显的增加(P<0.05),西药组与模型组相比,无明显差异(P>0.05)。4.2 Brdu/Nestin双标记阳性细胞数与正常组相比,模型组DG区内的Brdu/Nestin双标记阳性细胞数有明显的增加(P<0.01);与模型组相比,中药组的Brdu/Nestin双标记阳性细胞数有较为明显的增加(P<0.05),西药组与模型组相比,无明显差异(P>0.05)。4.3 Brdu/NeuN双标记阳性细胞数与正常组相比,模型组海马内的Brdu/NeuN双标记阳性细胞数有较为明显的减少(P<0.05)；与模型组相比,中药组的Brdu/NeuN双标记阳性细胞数有较为明显的增加(P<0.05),西药组与模型组相比,无明显差异(P>0.05)。4.4 Brdu/GFAP双标记阳性细胞数与正常组相比,模型组海马内的Brdu/GFAP双标记阳性细胞数有较为明显的减少(P<0.05)；与模型组相比,中药组、西药组的Brdu/GFAP双标记阳性细胞数有明显的增加(P<0.01或P<0.05)。结论：1 不确定空瓶刺激方法能够诱导Wistar大鼠出现明显的焦虑样行为学改变和典型的肝郁化火脾虚证候表现,是一种有效且稳定的广泛性焦虑障碍的造模方法。疏肝清热健脾法能够有效的改善GAD大鼠的焦虑状态以及伴见症状,并能明显提高大鼠的运动活力和探究能力。2 海马、杏仁核区内BDNF和NGF表达水平的下调有可能作为始动环节之一参与了GAD的发病,并且与Papez环路内的细胞损伤与凋亡密切相关；海马内的bFGF在机体内源性的神经修复与再生中发挥着积极、重要的作用。疏肝清热健脾法能够上调GAD大鼠海马、杏仁核内BDNF与受体TrkB、bFGF与受体bFGFR和NGF的表达,从而改善受损脑区微环境,增加神经可塑性,保护神经元,为神经修复与神经再生创造必要的、良好的条件。3 不确定空瓶刺激作为一种慢性心理应激因素,能够刺激GAD大鼠SGZ区NSCs的代偿性增殖,但抑制了NSCs向神经元和星形胶质细胞方向分化的能力。疏肝清热健脾法能够进一步刺激GAD大鼠SGZ区NSCs的增殖,并可以强化其分化能力,从而有效的促进相关脑区的神经修复与再生进程。4 CNS损伤后,机体自身存在着一定水平的修复与再生能力,但这种能力相对是比较微弱的,以丹栀逍遥散为代表的疏肝清热健脾法能够通过促进NTFs的分泌、增加神经的可塑性、强化内源性NSCs的增殖与分化能力等途径,促进GAD大鼠的神经修复与再生,这可能是疏肝清热健脾法临床治疗GAD有效的作用途径之一。