论文部分内容阅读
先天性甲状腺功能低下症(Congenital hypothyroidism,CH)是新生儿时期常见的一种内分泌疾病,若治疗不及时则会导致身体智力发育低下。促甲状腺激素受体(TSHR)在甲状腺发育和甲状腺激素分泌中发挥关键作用。研究发现,TSHR基因突变是导致CH发生的主要原因之一。本研究的第一部分是以来自西北地区的227例CH患者和200例健康人群为研究对象,采用高通量测序的方法对CH患者进行检测,筛查TSHR基因突变位点并利用生物信息学方法对突变位点进行致病性评估;第二部分是将筛选到的致病突变位点进行体外生物学功能研究,分析TSHR基因在CH产生过程中的分子致病机制。主要结果如下:(1)西北地区CH患者TSHR基因突变图谱分析:本研究发现227例CH患者中有16例患者存在TSHR疑似致病突变,占总患者人数的7%(16/227),比国内已有报道数据高(山东1/89和广西10/384),这些突变在健康对照人群中均没有检测到,为罕见突变,包括15个错义突变和1个无义突变,其中有12个突变位于10号外显子上,符合该外显子突变率较高的特点。在16个突变中,前人已报道或公共数据库中收录的已知突变有8个(p.N432S、p.R450H、p.F525S、p.A533T、p.I155L、p.A204V、p.E727D、p.H32Y),其中p.F525S突变在本研究的5例CH患者中都曾出现,检出频率为2.2%(5/227),是本次筛查的一个热点突变。16个突变中,除了p.F525S,其他15个突变在所有患者中都只出现一次,而p.R450H作为其他地区(日本和台湾)热点突变在本次筛查中只出现一次。同时,本研究中首次发现的新发突变有8个(p.V433I、p.M527K、p.R528S、p.A579V、p.K618*、p.C176R、p.K338E、p.N372T)。在3例患者中筛查到了复合型杂合子突变(p.R528S/p.R450H、p.C176R/p.K618*、p.M527K/p.A553T),并对患者父母进行家系验证发现这3例患者父母均各自携带有一个突变。利用五款软件(SIFT、PolyPhen-2、MutationTaster、FATHMM和M-CAP)对蛋白功能预测后发现有4个突变(p.R450H、p.N432S、p.C176R、p.K618*)的预测结果为有害(Damgaing),2个突变(p.E727D、p.K338E)的预测结果为良性(Tolerate)。此外,根据ACMG(美国医学遗传学与基因组学学会)遗传变异位点致病等级划分标准和指导原则,有8个突变划分为致病或可能致病的(p.R528S、p.C176R、p.K618*、p.F525S、p.A553T、p.N432S、R450H、p.A204V),p.E727D划分为良性突变,其余7个突变(p.V433I、p.M527K、p.A579V、p.K338E、p.N372T、p.H32Y、p.I155L)由于致病证据不足划分为意义不明(VUS)。(2)TSHR突变分子致病机制研究:我们选取4个有家系验证的突变位点(p.R528S、p.C176R、p.K618*、p.R450H)进行生物学功能实验,通过实时定量PCR和Western blot实验结果显示4个突变体的mRNA和蛋白质均有表达,与野生型TSHR蛋白表达不具有显著性差异。利用流式细胞术检测细胞表面TSHR蛋白时没有检测到p.C176R(c.526T>C)和p.K618*(c.1852A>T)这两个突变体的蛋白,但是检测到了p.R450H(c.1349G>A)和p.R528S(c.1582C>A)这两个突变体蛋白。