目的：　　乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus,HBV）是一种不完全闭合的双链嗜肝DNA病毒，具有严格的组织特异性和种属特异性。建立理想的HBV动物模型是一个世界难题。传统的HBV动物模型有黑猩猩、土拨鼠、树鼩、鸭等，在乙型肝炎病毒感染研究中发挥着重要作用，但现有模型都存在一定的局限性。建立理想的HBV动物模型，除动物质量外，HBV基因组也是一个很重要的因素。在已报道的HBV动物模型中，并未见其详细的目的基因背景的分析结果，限制了模型更好的应用。因此，在动物质量保证的前提下，明确HBV基因序列的基本信息，为更好的建立模型和利用模型奠定基础。本研究的目的是对天然的HBV毒株的自然遗传变异进行分析，并对其功能进行体内初步验证，为乙肝模型的个体化建立提供方法学及乙型肝炎的个体化治疗和精准治疗奠定基础。　　方法：　　1.从53例病人中筛选出具有代表性的病人血清DNA，利用PCR扩增HBV全长基因，分子生物学方法将HBV全长基因克隆到pEASY-Blunt Simple载体上，构建成为pEASY-HBV质粒，通过sanger测序方法鉴定。　　2.利用多序列比对和进化树分析的方法进行序列分析，得出序列在进化中的位置及变异位点。　　3.随机抽取8只实验小鼠进行病毒质量检测，主要包括ELISA方法检测M-Ect、MHV、MNV和MSV。　　4.选取6周龄和12周龄的CBA/CaJ雌性和雄性小鼠检测基础生物学指标，主要包括小鼠体重及主要脏器重量的测定，全自动生理生化分析仪检测生理生化指标，流式细胞分选的方法检测B细胞、T细胞、NK细胞以及粒细胞比例。　　5.利用PCR扩增所筛选的HBV全长基因，纯化回收，用BspQI酶切并纯化回收产物，然后16℃条件下利用T4DNA连接酶进行过夜连接，环化成共价闭合环状的DNA(covalently closed circular DNA,cccDNA)，然后将环化产物纯化回收并对回收的环化产物进行EcoRI及PSAD酶切和测序鉴定。　　6.通过尾静脉高压注射的方法将HBV cccDNA、pAAV/HBV1.2质粒和生理盐水分别注射到CBA/CaJ小鼠体内，于第0.5w,1w,2w,3w,4w,5w,6w,8w,9w,14w,18w,22w,24w和26w通过小鼠尾静脉采取血清样本。　　7.通过放射免疫法检测所采血清样本病毒血清特异性标志HBsAg和 HBeAg的表达。　　结果：　　1.从53例病人中筛选出1例具有代表性的男性患者的血清DNA（B型、HBeAg阴性），成功构建了pEASY-HBV HBeAg阴性的质粒并测序完成。　　2.该野生株基因组全长为3215 bp，4个开放读码框（ORF）完整。进化树结果显示该序列的基因型是B型，基因亚型B2型；基础核心启动子区（BCP）有两个主要突变位点：ntA1762T、ntG1764A；在前C区（PC）有两个主要突变位点：ntG1896A和ntG1899A;突变ntG1896A使相应的密码子变成了终止密码子TAG；在S区域（SORF）的122、125、127和160氨基酸位点分别被确定为Lys(K),Thr(T)，Pro（P）和K。表明其血清型亚型为adw2型，在SORF没有已报道的免疫逃逸位点；在PORF没有已报道的耐药突变位点。　　3.小鼠M-Ect、MHV、MNV和MSV检测结果均为阴性。　　4.同周龄（6周龄或12周龄）雌雄小鼠相比较，雄性体重、心脏、肝、肾重量均显著高于雌鼠（P＜0.01）；同性别不同周龄小鼠，12周龄雄鼠体重显著高于6周龄雄鼠（P=0.000），雌鼠体重无显著差异。12周龄鼠心脏显著高于6周龄。6周龄雌雄小鼠相比较，雄性MCV、RDW、PLT、P-LCR、BUN及CHOL均显著高于雌鼠（P＜0.01），而雄性的MCHC显著低于雌性（P=0.000）。12周龄雄鼠的ALKP显著低于雌鼠（P=0.001），CHOL显著高于雌鼠（P=0.000），其他指标无显著性差异。同性别不同周龄小鼠，12周龄小鼠MCV、RDW、MCH及ALKP明显低于6周龄（P＜0.01），而BUN显著高于6周龄（P＜0.01）。所有小鼠均可检测到一定比例免疫细胞。　　5.酶切鉴定结果显示线性DNA成功环化成cccDNA；测序结果显示cccDNA没有碱基的缺失、改变和外源基因的插入。　　6.在注射cccDNA的CBA/CaJ小鼠中，HBsAg可持续表达26周以上，HBeAg阴性。注射pAAV-HBV1.2质粒的CBA/CaJ小鼠，血清中均可检测到HBsAg和HBeAg。　　结论：　　1.ntA1762T和ntG1764A位点的突变降低了HBeAg的表达；ntG1896A突变形成终止密码子终止了HBeAg的表达。所获得的HBV病毒为具有代表性的HBeAg阴性、B型和adw血清亚型的毒株，可作为中国HBV HBeAg阴性毒株的重要参考株。　　2.CBA/CaJ小鼠病毒检测质量合格，可保证HBV动物模型的动物质量准确性。　　3.建立了CBA/CaJ小鼠的基础生物学数据。CBA/CaJ小鼠表现为免疫功能健全。其龄期和性别因素对其生物学指标都有一定的影响。　　4.建立了获取大量cccDNA的新方法。　　5.在具有免疫活性的CBA/CaJ小鼠中成功建立了HBeAg阴性的HBV感染持续性长达26w的动物模型。