【摘 要】
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自噬的机制在进化上是极其保守的,同时也是一个精确协调的过程。在癌症中,自噬通过抑制肿瘤起始但支持肿瘤进展中扮演着两面性的角色——一方面,在某些不利的环境条件中,自噬机制可以显著增强某些癌症细胞的对环境应激因素的生物耐受能力,包括抵抗致癌瘤环境的胁迫反应和接受抗肿瘤的药物治疗,保护细胞其正常存活。另一方面,在人类癌症细胞发展的各个阶段,自噬也同样可以有效控制缺陷癌症细胞凋亡,甚至直接诱发凋亡导致缺陷
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自噬的机制在进化上是极其保守的,同时也是一个精确协调的过程。在癌症中,自噬通过抑制肿瘤起始但支持肿瘤进展中扮演着两面性的角色——一方面,在某些不利的环境条件中,自噬机制可以显著增强某些癌症细胞的对环境应激因素的生物耐受能力,包括抵抗致癌瘤环境的胁迫反应和接受抗肿瘤的药物治疗,保护细胞其正常存活。另一方面,在人类癌症细胞发展的各个阶段,自噬也同样可以有效控制缺陷癌症细胞凋亡,甚至直接诱发凋亡导致缺陷肿瘤细胞死亡[4-7]。虽然越来越多的临床证据表明,靶向自噬可以提高癌症治疗的疗效,用于单独或联合治疗抑制肿瘤扩增,但是,仍然需要关注选择性抑制肿瘤的自噬调节靶点,和相应的特异性的自噬调节小分子。本课题组在2020年报道了热休克蛋白70（Hsp70）是一种新的类Bcl-2蛋白,并发现Hsp70与BH3-only蛋白Bim具有蛋白-蛋白相互作用。而且Hsp70/Bim是CML的特应性肿瘤靶标。我们课题组也研发了第一个特异性解离Hsp70-Bim PPI的小分子S1g-2。进一步发现在BCR-ABL非依赖TKI耐药患者的样本中解离Hsp70/Bim二聚体的致死率比TKI敏感患者更高,并随着BCR-ABL非依赖TKI耐药性的增加逐渐增强。有趣的是,通过si RNA筛选发现Hsp A1L（Hsp70成员）调控Parkin易位可能能够增加线粒体质量控制,与自噬有密切关系。而在S1g-2影响的Hsp70蛋白的互作蛋白质组中,我们也发现了Parkin和TOMM20。因此,本文章利用特异性解离Hsp70-Bim PPI的小分子S1g-2,与它的类似物S1（已被证明特异性解离Bcl-2/Beclin-1二聚体）作为化学工具。基于细胞的研究和体外研究,发现了Bim是Hsp70的辅伴侣蛋白,并发现了Bim与Hsp70这对新二聚体的功能,揭示了Hsp70-Bim PPI通过线粒体自噬和细胞凋亡来保护细胞,作为双重功能的“救生员”。因此,S1g-2代表了一种新的基于自噬机制的抗肿瘤候选药物,可以引导细胞自噬和凋亡走向。通过对不同条件下自噬蛋白表达水平的检测,发现在没有凋亡对自噬诱导干扰的情况下,S1增强了应激诱导的自噬,S1g-2抑制了应激诱导的自噬。利用化学蛋白质组学鉴定了S1g-2的自噬调控靶点为Hsp70蛋白,S1的自噬调控靶点为Bcl-2和Mcl-1。通过同时检测自噬蛋白表达水平和Hsp70/Bim相互作用蛋白含量发现了自噬水平的提高是由Hsp70/Bim二聚体介导的。通过吖啶橙染色及干扰RNA进一步证明了S1g-2抑制HBSS诱导的自噬是通过Hsp70/Bim二聚体的解离。通过S1g-2与溶酶体抑制剂巴菲霉素A1（Baf A1）对比实验,发现Hsp70-Bim PPI影响诱导性自噬,而不影响基础自噬。通过分别检测线粒体、内质网及高尔基体细胞器中自噬蛋白水平、细胞器特异表达蛋白水平的检测及自噬蛋白LC3与线粒体的共定位,发现Hsp70/Bim二聚体特异性调节线粒体自噬,而对内质网和高尔基体自噬水平没有影响,是一个选择性自噬靶标。通过细胞的研究和体外泛素化分析应激诱导的Hsp70与Bim、Parkin、TOMM20相互作用蛋白及TOMM20泛素化水平,发现Hsp70-Bim PPI招募了Parkin和TOMM20复合物,促进了Parkin移位至线粒体、泛素化TOMM20并促进线粒体自噬。通过Bax/Bak双敲除（DKO）小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）实验及稳定转染四环素诱导表达Bim实验发现其机制不依赖于Bax/Bak。通过检测S1g-2对AMPK磷酸化水平,发现S1g-2选择性地抑制应激诱导的自噬,而不干扰AMPK途径说明其机制与能量无关。这些发现说明了Hsp70-Bim PPI通过线粒体自噬来保护细胞凋亡,作为双重功能的“救生员。”综上所述,这些结果表明Hsp70-Bim PPI介导了线粒体自噬,S1g-2通过解离Hsp70-Bim PPI抑制自噬活性。说明S1g-2为研究Hsp70-Bim PPI在自噬过程中未知的分子生物学作用提供了理想的工具,同时是一个以自噬为机制的抗癌靶标。
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