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紫外线B(ultraviolet B,UVB)辐照损伤的敏感部位之一为动物的眼睛,角膜上皮作为眼对外界刺激的第一道屏障能吸收大部分到达眼的UVB,而过量UVB会诱导角膜上皮细胞发生凋亡且该凋亡与UVB呈剂量依赖性。但少有研究报道UVB辐照诱导角膜上皮细胞凋亡的动态变化及其时序。研究表明枸杞多糖(Lycium barbarum polysaccharides,LBPs)可以通过抑制多种损伤源诱导的细胞凋亡来保护晶状体上皮细胞、视网膜色素上皮细胞、感光细胞等多种眼细胞。但LBPs是否能抑制UVB辐照诱导的凋亡来保护角膜上皮细胞及其机理尚无研究报道。本文首先从成年标准体重Wistar品系雌鼠提取原代角膜上皮细胞并进行体外培养,使用角膜上皮特异性标记蛋白——细胞角蛋白3和12(cytokeratins3+12),利用免疫荧光技术鉴定原代细胞纯度后将该细胞用于后续实验。实验通过检测144 mJ/cm~2 UVB辐照大鼠角膜上皮(rat corneal epithelial,RCE)细胞24h内不同时间点上细胞形态、细胞活力、细胞凋亡率、线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,MMP)及凋亡相关基因(Bax、caspase-8、caspase-3)表达水平的变化研究了UVB辐照诱导RCE细胞凋亡的动态变化及其时序。使用LBPs保护和没有使用LBPs保护的RCE细胞经UVB辐照后,通过检测细胞活力、细胞形态、细胞核形态、细胞凋亡率的变化阐明了LBPs是否能抑制UVB辐照诱导的凋亡来保护角膜上皮细胞的问题;通过检测MMP、凋亡相关基因(Bax、Bcl-2、caspase-3)表达水平、JNK磷酸化水平及活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平的变化揭示了LBPs抑制凋亡的机理;通过转录组测序后差异表达基因的分析进一步探究了UVB辐照对RCE细胞的损伤与LBPs的保护作用。实验结果显示:成功提取并培养了原代RCE细胞,细胞呈单层成纤维样贴壁生长,传代后细胞界限明显、胞体圆润,细胞随着增殖逐渐融合,当融合至80-90%时进行传代处理;统计细胞角蛋白3和12的免疫荧光染色结果得到,经原代培养所得的RCE细胞的纯度约为80%。144 mJ/cm~2 UVB辐照RCE细胞后的24 h内,caspase-8和Bax在辐照后0 h时表达量最高;MMP在辐照后0 h时下降且在6 h内保持不变;辐照后6 h时,caspase-3被激活且此时细胞活力最低而凋亡率最高;caspase-3在辐照后12-24 h表达量下降,细胞凋亡率随之下降且晚期凋亡细胞比例下降。不同浓度LBPs对RCE细胞活力的影响为0-1 mg/m L无影响、5 mg/mL增加细胞活力、10 mg/m L降低细胞活力。0.05–1 mg/m L LBPs阻止UVB辐照诱导的RCE细胞活力的下降且该作用的最佳浓度为1 mg/m L;1mg/m L LBPs显著抑制了UVB辐照诱导的RCE细胞凋亡形态与凋亡核形态的发生,将凋亡核比率从UVB辐照后的38.06%±7.02%降低到了18.51%±0.94%,并将UVB辐照诱导的RCE细胞的凋亡率从47.06%±1.83%降低到了13.93%±1.76%。1 mg/m L LBPs显著抑制UVB辐照诱导的RCE细胞MMP的下降(P<0.05),将RCE细胞Bax/Bcl-2比值从UVB辐照后上升8.26±0.79倍抑制到了2.91±0.08倍;1 mg/m L LBPs分别在mRNA水平和蛋白水平显著抑制了UVB辐照诱导RCE细胞caspase-3的上调(P<0.01),显著减弱了UVB辐照诱导的JNK磷酸化(P<0.05);1 mg/m L LBPs使ROS水平从UVB辐照后上升2.41±0.15倍回落到了1.44±0.17倍。转录组测序结果显示,UVB辐照使RCE细胞产生4373个差异基因,其中1433个上调、2940个下调,经1 mg/m L LBPs处理后,差异基因数减少到了1941个,其中1326个上调、615个下调;将差异基因进行GO(gene ontology)功能富集,发现UVB发挥损伤作用与LBPs发挥保护作用主要涉及的生物进程为细胞通讯与信号转导,细胞响应刺激与对伤害的响应,细胞组分与亚细胞组分迁移,DNA转录、RNA与生物大分子的合成与代谢,免疫反应、细胞防卫响应与细胞因子的产生,炎症反应,细胞运动与移行等;差异基因的KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)富集分析再一次表明凋亡通路中的线粒体途径和JNK通路参与到UVB辐照诱导RCE细胞凋亡与LBPs抑制该凋亡的过程中。综合以上研究结果,过量UVB辐照可诱导RCE细胞活力下降和发生细胞凋亡且该凋亡是一个快速而有序的过程。LBPs可以通过抑制UVB辐照诱导的细胞凋亡来保护RCE细胞,其机理为抑制Bcl-2的下调、Bax的上调、MMP的下降以及caspase-3的上调,即削减凋亡的线粒体途径,抑制JNK磷酸化水平以及抑制细胞ROS水平的升高。LBPs在转录组水平减少了UVB辐照诱导的差异表达基因的个数。本论文的工作完善了UVB辐照诱导角膜上皮损伤的相关研究,填补了LBPs在对抗UVB辐照诱导的凋亡与损伤和对角膜细胞保护研究上的空白,使用转录组测序探究LBPs的作用也尚属首次。