【摘 要】
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Ercc61(excision repair cross-complementing rodent repair deficiency,complementation group 6-like)基因是在寻找胚胎发育相关基因的研究中,采用EST介导的基因克隆策略,
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Ercc61(excision repair cross-complementing rodent repair deficiency,complementation group 6-like)基因是在寻找胚胎发育相关基因的研究中,采用EST介导的基因克隆策略,从小鼠胚胎克隆的新基因。该基因长4002bp,定位于X染色体,最大开放阅读框(ORF)编码一1240个氨基酸组成的假定蛋白,属于SNF2家族ERCC6亚家族。表达谱分析提示该基因的功能可能与胚胎发育和肿瘤发生有关。初步研究结果提示Ercc61是小鼠胚胎发育相关基因,酒精致畸作用的分子靶点。本文主要在细胞学水平研究了基因Ercc61与P19胚胎癌细胞的关系。 研究目的:探讨基因Ercc61在P19胚胎癌细胞及P19分化细胞中的表达情况,并构建Ercc61的正、反义真核表达载体,在细胞学水平对基因功能进行初步研究。 研究方法:用一定浓度的二甲亚砜(DMSO)和维甲酸(RA)分别诱导处理P19胚胎癌细胞,使其分别向心肌细胞方向和神经细胞方向分化,提取P19细胞总RNA,RT-PCR检测P19细胞诱导分化前后Ercc61 mRNA的表达变化。用限制性内切酶Xho Ⅰ和Kpn Ⅰ双酶切含目的基因的pGEM-T-Ercc61载体,获得目的基因Ercc61序列,将其插入到真核表达载体pcDNA3.1(+)和pcDNA3.1(-)Myc His6多克隆位点的Xho Ⅰ和Kpn Ⅰ的酶切位点,相连构成基因表达质粒。将重组后的质粒进行细菌转化,先菌落PCR鉴定,然后质粒扩增、纯化后,再限制性内切酶Xho Ⅰ和Kpn Ⅰ酶切鉴定。以脂质体介导的方法体外瞬时转染正义载体至P19细胞,RT-PCR检测基因在细胞内的表达活性情况,并用MTT
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