病理性心肌纤维化是心血管疾病中的一个重要研究课题。近年来,干细胞移植在缺血性心脏病的治疗领域显示出独特的魅力。尽管在药物干预、介入治疗和外科手术方面取得了可喜的进展,使心肌纤维化的症状改善,闭塞的血管再通,但是心肌细胞缺乏增殖能力,对于已经梗死的心肌细胞和纤维化的心肌尚无办法使其恢复并发挥正常的舒缩功能。20世纪90年代以来,随着干细胞生物工程的蓬勃开展,具有多向分化潜能和自我复制能力的干细胞给心血管疾病的治疗带来了新的突破性的进展。在细胞心肌成形术中,常用的干细胞有骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cell,BMSC)、造血干细胞、内皮祖细胞、胚胎干细胞、骨骼肌成肌细胞等。BMSC取材方便、数量丰富、免疫排斥性低、不存在伦理争议、能分化为心肌细胞,这些优点使BMSC成为细胞心肌成形术治疗中的较优选择。干细胞移植修复损伤心肌具有广阔的临床应用前景,但一些亟待解决的瓶颈问题制约着细胞心肌成形术的发展应用。随着研究不断深入,人们发现移植入的干细胞有效归巢到受损靶位的数量极少。这直接影响了干细胞的修复效果。此外,干细胞修复心肌纤维化的病理生理机制尚不完全清楚。经静脉移植BMSC安全性高、易操作,但靶向性差、效率低。因此找寻一种既能从静脉移植,又能提高移植效率的方法极为重要。同时,这种方法若能增加BMSC的归巢率、优化归巢微环境,将使纤维化心肌的修复效果事半功倍。近年来研究发现,超声微泡不仅是一种可以用于增强超声组织灰阶显像的造影剂,而且可作为一种新型的药物或基因运载工具。将特定的药物或基因与微泡结合在一起,通过外周血管注射,经体外超声定位辐照破坏与之结合的微泡,可使药物或基因在特定组织内定位释放,微泡破裂后引起机械效应和空化效应可使靶组织内毛细血管内皮间隙增宽或破裂,基因或药物可进入特定的组织内。前期研究显示超声微泡可促进肝细胞生长因子成功转移至大鼠缺血心肌,促进血管新生,微血管密度有明显的增加。亦有研究证实,超声破坏微泡可增加局部血管内皮细胞胞膜粘附分子的表达,从而促进骨髓单个核细胞粘附于内皮上,基于这些理论基础,超声破坏微泡技术是否可以作为一种新型的促进干细胞定向移植的有效方法有待进一步进行探讨。CD29抗体是BMSC表面高表达的分子标志;抗肌凝蛋白轻链抗体(anti-myosin light chain antibody, AMLCA)是损伤心肌特异性抗体。AMLCA能与心室肌特异性地结合,而与肝、脾、肾等非肌性组织以及骨骼肌、血管和肠平滑肌无交叉反应。有研究发现,急性心肌损伤发生后AMLCA可通过破裂的肌细胞膜与坏死心肌结合,而不是与细胞膜完整的正常心肌细胞结合。本课题首先构建CD29×AMLCA这一双特异性抗体(bispecific antibody, BiAb),然后将BiAb和超声辐照微泡作为增效措施,辅助BMSC移植入心肌纤维化小鼠,检测BMSC归巢率的变化,同时探讨BMSC修复心肌纤维化的可能机制。除了对BMSC在增效措施下干预心肌纤维化的效果和机制进行探讨外,本课题还开展了心肌纤维化血浆标志物PⅢNP预测冠心病合并代谢综合征患者近期心脏重塑及预后的探索性研究。在冠心病人群中,许多患者同时合并代谢综合征,如何客观衡量并预测这类患者的心血管重塑程度,并判断其预后,具有重要临床价值。间质胶原代谢失衡是心血管重塑的重要形态基础,血浆胶原标志物PⅢNP与慢性心衰、急性心梗相关。冠心病合并代谢综合征患者罹患慢性心衰的风险较大,这类人群的心血管重塑引起心功能恶化、动脉顺应性下降,活动耐力降低。血浆胶原标志物PⅢNP在冠心病合并代谢综合征患者中意义如何,与动脉粥样硬化疾病及其危险因素的相关性尚不完全清楚。此部分研究用血浆胶原标志物PⅢNP判断冠心病合并代谢综合征患者的近期心血管重塑程度,并预测其发展趋势,探寻心肌纤维化血浆标志物对预后的判断价值。综上,本课题主要包括以下五部分内容:第一部分心肌纤维化模型制备及其胶原沉积机制目的建立理想的心肌纤维化小鼠模型并探讨其胶原沉积机制。方法将BALB/c小鼠随机分为实验组和对照组,每组10只。实验组予以腹部皮下注射异丙肾上腺素50mg/kg,每天2次,连续10天。对照组同法注射生理盐水。45天后处死小鼠,天狼猩红染色观察心脏Ⅰ、Ⅲ型胶原纤维含量,荧光定量PCR检测心脏基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinases-9,MMP-9)、基质金属蛋白酶组织抑制剂-1(tissue inhibitor of metalloproteinase-1,TIMP-1)基因表达,免疫组化染色分析心、肝、肾组织层粘连蛋白(laminin,LN)的表达。结果实验组小鼠心脏胶原沉积较多,MMP-9、TIMP-1、LN表达上调(p<0.05),肝、肾组织LN无明显改变(p>0.05)。结论异丙肾上腺素能制备理想的心肌纤维化小鼠模型,其机制与心脏MMP-TIMP失衡有关。第二部分小鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养、鉴定目的建立一种分离、培养小鼠骨髓间充质干细胞(BMSC)的稳定方法,并通过形态学、细胞表型、功能学指标进行鉴定。方法无菌分离小鼠股骨,以全骨髓贴壁法培养BMSC。稳定传代后,以光镜形态学观察,CD29、CD44、CD117流式细胞术,成骨、成脂诱导培养鉴定BMSC。结果全骨髓贴壁培养法能获得稳定的BMSC,呈平行排列或漩涡状生长。细胞呈梭形或多角型,CD29、CD44、CD117阳性表达率分别为99.94%、99.28%、1.35%,诱导成骨、成脂分化成功。结论全骨髓贴壁法能从小鼠骨髓中分离培养出均质性良好的BMSC。第三部分超声微泡及双特异性抗体增效骨髓间充质干细胞归巢及干预心肌纤维化目的探讨骨髓间充质干细胞(BMSC)在BiAb和超声辐射微泡(microbubble, MB)的辅助下归巢并干预心肌纤维化的效果。方法以CD29抗体(能识别间充质干细胞)和抗肌凝蛋白轻链抗体(AMLCA)(能特异性结合损伤心肌)制备BiAb(CD29×AMLCA)。将此BiAb与雄性小鼠BMSC输入异丙肾性心肌纤维化雌性小鼠,辅以超声辐照微泡(BMSC+BiAb+MB组)。另设单纯BMSC组、单纯BiAb组、单纯MB组、BiAb+BMSC治疗组、正常对照组、未治疗组。5周后处死小鼠,荧光定量PCR检测心肌Y染色体鉴别基因(sex-determining region of Y-chromosome,SRY)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、基质金属蛋白酶组织抑制剂-1(TIMP-1)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表达。天狼猩红染色观察胶原分布,western-blot观测心脏信号转导与转录激活因子1(signal transducer and activators of transcription-1,STAT1)和信号转导与转录激活因子3(signal transducer and activators of transcription-3,STAT3)的表达。结果BMSC归巢数最多的是BMSC+BiAb+MB组,其次为BMSC+BiAb组,BMSC组归巢数最少。与未治疗组相比,BMSC+BiAb+MB组、BMSC+BiAb组和单纯BMCS组的心肌MMP-9、TIMP-1和STAT1表达下调,STAT3表达升高,胶原沉积降低(p<0.05)。其中,与单纯BMSC组相比,BMSC+BiAb+MB组的心肌STAT3表达明显上调,TIMP-1明显下调(p<0.05)。结论CD29×AMLCA双特异抗体可促进小鼠BMSC的归巢,联合超声辐射微泡,可进一步增加干细胞的归巢率和修复效果。BMSC归巢后能改善缺血心肌MMP-TIMP表达,干预心肌纤维化,其机制可能与心肌STAT介导的信号通路有关。第四部分骨髓间充质干细胞干预心肌纤维化的可能机制目的探讨骨髓间充质干细胞(BMSC)移植干预心肌纤维化的可能机制。方法分离培养雄性小鼠BMSC,经尾静脉输入异丙肾性心肌纤维化雌性小鼠(治疗组)。另设未治疗组和正常对照组。5周后处死小鼠,免疫组织化学染色法观察心脏核转录因子-κb(nuclear factor-κb ,NF-κb)、核增殖抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)和细胞凋亡蛋白酶(caspase-3)的表达,荧光定量PCR检测心肌SRY、MMP-9、TIMP-1的表达,天狼猩红染色观察胶原分布。结果与未治疗组相比,治疗组心肌有雄性BMSC归巢,胶原沉积减少,NF-κb、caspase-3表达下调,PCNA表达增加(p<0.05)。结论BMSC移植到纤维化心肌,能抑制NF-κb过度活化,改善心肌增殖-凋亡状态。其干预机制与细胞因子网络介导有关。第五部分PⅢNP预测冠心病合并代谢综合征患者近期心脏重塑程度及预后目的探讨血浆Ⅲ型前胶原氨基末端肽(PⅢNP)对冠心病合并代谢综合征患者心血管重塑及预后的预测价值。方法连续入选108例冠心病合并代谢综合征患者(平均年龄63.29±3.32岁,女性56%),放免法测定PⅢNP水平,检测并随访1年后患者心脏、颈动脉彩超、6分钟步行距离(6MWT)。根据PⅢNP的中位数水平(3.5μg/L)将受试者分为高低水平两组,统计其各指标差异,多元逐步回归分析影响PⅢNP的因素,并分析PⅢNP与心血管重塑程度的相关性,COX比例风险模型分析心脑血管事件再入院的预测因子,ROC曲线分析PⅢNP判断再住院的阈值。结果血浆PⅢNP水平与冠心病合并代谢综合征患者年龄(β=0.686,p<0.001),高敏C反应蛋白(β=0.194,p=0.001),BMI(β=0.108,p=0.023)相关。与PⅢNP<3.5μg/L组相比,PⅢNP≥3.5μg/L组患者的心律不齐发生率、1年内再住院率和左心室心肌重量指数(LVMI)明显增加,6MWT缩短(p均<0.05)。随着Ln PⅢNP(r=0.271,p=0.007)升高,随访期间心脏重塑程度加重。COX比例风险模型显示,PⅢNP、LVEF、高敏C反应蛋白水平是冠心病合并代谢综合征患者随访期间心脑血管事件再住院的独立预测因子。PⅢNP4.0μg/L为衡量心脑血管事件再住院的最佳阈值。结论PⅢNP随冠心病合并代谢综合征患者的年龄、高敏C反应蛋白、BMI增加而上升,高水平的PⅢNP提示患者近期心脏重塑增加、活动耐力下降、预后不良。