研究背景肠易激综合征（Irritablebowel syndrome,IBS）是一种常见的功能性消化系统疾病,主要临床表现为腹痛、腹部不适、排便习惯改变和大便性状异常等。研究统计,IBS影响了全世界超过11%的人口,尽管它不是一项致畸或致死性疾病,但它仍严重影响了患者的生活质量并带来了沉重的经济负担。IBS的发病机制目前尚不完全清楚,研究证实有多种病理生理机制参与了IBS的发生和发展。目前已有研究证据表明许多IBS患者存在肠道菌群失调和内脏高敏感,并且有研究观察到将IBS患者的粪菌移植到无菌小鼠体内后会引起明显的内脏超敏反应和运动功能障碍。这提示IBS肠道菌群失调很可能参与了内脏高敏感的发生。肠道上皮可以接收肠道菌群的刺激,其中肠嗜铬细胞（Enterochromaffin Cells,EC）作为一种分布于肠道上皮的重要的神经内分泌细胞,不仅可以接收来自肠道细菌成分及其代谢产物的多种刺激,还能够影响肠道代谢、动力和内脏感觉。因此EC细胞很有可能是IBS肠道菌群失调和内脏高敏感状态之间的重要桥梁。然而肠道菌群种类繁多,数量庞大,其中具体是哪种细菌在IBS内脏高敏感的发生和发展中发挥了关键作用,其具体作用机制如何,目前尚无明确定论。明确影响内脏高敏感的关键微生物及其作用机制,对IBS的预防和治疗具有重大临床意义。因此本研究拟分为三个部分,分别对在IBS中可能发挥重要作用的细菌;其对肠道菌群失调和内脏高敏感状态的影响;及其可能的作用机制进行探索。第一部分腹泻型肠易激综合征患者肠道菌群失调的特征性改变研究目的:肠道菌群失调被认为在IBS的发病过程中具有重要作用。人类肠道内寄居着多达1013-14的微生物,在健康状况下肠道菌群通过共生或拮抗的模式,维持着宿主肠道菌群的稳态平衡,而疾病状态下,肠道菌群稳态则被打破。目前已有研究证据表明部分IBS患者存在肠道菌群失调,然而关于其中发挥关键作用的微生物目前仍存在争议。因此我们对IBS患者的肠道菌群特征进行了评估。研究方法:于山东大学齐鲁医院招募年龄为18-65岁的腹泻型肠易激综合征（Diarrhea predominant-IBS,IBS-D）患者（根据罗马Ⅳ标准诊断）和健康志愿者。对符合入组标准但不符合排除标准的IBS-D患者和健康志愿者的一般资料进行记录。采用IBS症状严重程度量表（IBS-SSS）评估IBS-D患者的症状严重程度。采用焦虑自评量表（SAS）和抑郁自评量表（SDS）评估IBS-D患者焦虑和抑郁程度。留取所有IBS-D患者和健康志愿者的粪便样本,进行16S rRNA高通量测序和分析。研究结果:最终共纳入了 71例IBS-D患者和39例健康志愿者。IBS-D患者和健康志愿者在年龄、性别和身体质量指数（Body mass index,BMI）方面均无明显差异。通过计算Shannon指数比较组间微生物α-多样性,IBS-D患者的Shannon指数较健康志愿者显著降低（P<0.05）。通过NMDS分析β-多样性,结果显示IBS-D患者的微生物结构与健康志愿者不同（P<0.05）。物种组成分析显示,在门水平上,IBS-D患者和健康志愿者均以Fimicutes为最优势菌,而属水平上则以Bacteroides、Blautia、Faecalibacterium等为主要优势菌。通过LEfSe分析确定与IBS-D相关的可能微生物生物学标志物（Biomarker）。结果显示,Faecalibacterium、Ruminococcus和Subdoligranulum等在健康志愿者肠道菌群中高度富集,在IBS-D患者中,Prevotella、Streptococcus和Fusobacterium等显著富集。其中梭杆菌于各分类水平上都是IBS-D患者可能的Biomarker。进一步分析发现,作为区分IBS-D患者和健康志愿者的一个单一因素,Fusobacterium（属水平）的受试者工作曲线（Receiver operating curve,ROC）曲线下面积为 0.727（P<0.001）,敏感性和特异性分别为57.7%和84.6%,且IBS-D患者的Fusobacterium丰度显著高于健康志愿者（P<0.001）。不仅如此,IBS-D患者中Fusobacterium的丰度与SDS值还呈现出明显的正相关（P<0.05）。提示Fusobacterium很可能是参与IBS发生和发展的关键菌属。研究结论:1.IBS-D患者存在明显的特征性肠道菌群失调,其菌群多样性和物种组成均较健康志愿者存在明显差异。2.IBS-D具有多种可能的Biomarker,其中Fusobacterium可能参与了 IBS的发生和发展并发挥了重要作用。第二部分:具核梭杆菌参与肠易激综合征动物模型菌群失调和内脏高敏感的作用研究研究目的:肠道菌群失调被证实很有可能参与IBS内脏高敏感的形成。在第一部分研究中我们发现Fusobacterium是IBS-D可能的生物标志物且与IBS-D患者抑郁倾向相关。因此,Fusobacterium可能与IBS的内脏超敏反应密切相关。具核梭杆菌（Fusobacterium nucleatum,F.nucleatum）是Fusobacterium最具代表性的菌株,它是一种革兰氏阴性的专性厌氧菌,是口腔黏膜中的常见共生菌。研究证实F.nucleatum参与了多种消化道疾病的发生和发展,例如阑尾炎,结肠癌和炎症性肠病等。此外,F.nucleatum还与口腔中的疼痛和冷敏感相关。因此我们通过IBS动物模型对F.nucleatum是否能够影响肠道菌群的稳态,并参与IBS内脏高敏感状态形成进行了探索。研究方法:1.构建母婴分离（Maternalseparation,MS）大鼠模型,并于出生后第4-8周分别接受F.nucleatum或生理盐水灌胃,每周一次,灌胃结束后休息4周。于出生后第3、8、12周分别留取大鼠粪便。2.将大鼠粪便进行16S rRNA高通量测序并分析,评估MS和F.nucleatum对肠道菌群的影响。3.于出生后第12周对大鼠进行结直肠扩张（Colorectal distension,CRD）实验,观察大鼠腹壁撤退反射（Abdominal withdraw reflex,AWR）并记录评分以评估其内脏高敏感程度。4.PCR方法检测F.nucleatum定植。5.提取大鼠粪便上清,使用Western blotting方法检测粪便上清中F.nucleatum特异性IgA的变化。6.提取IBS-D患者和健康志愿者的粪便上清,使用Western blotting方法检测F.nucleatum特异性IgA在两者间是否存在差异,并通过Spearman相关性分析F.nucleatum特异性IgA与SAS、SDS是否相关。研究结果:1.通过16S rRNA高通量测序分析显示MS和F.nucleatum均导致了大鼠肠道菌群的改变。α-多样性方面,灌胃后对照组Shannon指数在第8周时显著高于其他三组（P<0.05）,不仅如此,Sobs值和Chao1值也提示MS和F.nucleatum灌胃均能降低肠道菌群的多样性。而OTU数据通过NMDS分析进行聚类观察β-多样性,显示对照组在灌胃后的第8周明显与其他三组分离。2.CRD实验显示大鼠在0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml、1.2ml、1.4ml的球囊扩张压力下AWR评分均有显著差异（P<0.05）,将上述AWR评分求和做为内脏超敏指数进一步分析显示MS并接受F.nucleatum灌胃的大鼠内脏超敏指数高于MS并接受生理盐水灌胃的大鼠（P<0.05）。3.PCR结果显示F.nucleatum未在肠道中定植,为进一步挖掘F.nucleatum作用机制,通过Western blotting法检测大鼠粪便上清中F.nucleatum特异性IgA。结果显示,灌胃后在第8周,大多数接受F.nucleatum灌胃的大鼠样本中检测到分子量分别为40kDa和130kDa的两个强反应条带,这两条带在第12周仍然存在。进一步进行灰度分析发现在上述两反应条带的灰度比例信号在第8周和12周均具有显著的组间差异（P<0.05）。4.为验证F.nucleatum特异性IgA是否与IBS存在关联,通过Western blotting对7例IBS-D患者和5例健康志愿者的粪便上清进行检测,结果显示相比于健康志愿者,IBS-D患者同样在130kDa和40kDa观察到两条强反应带,且灰度分析均具有统计学差异（P<0.05）。此外,上述两条带灰度比例信号与SAS和SDS评分均呈现明显正相关（P<0.05）。研究结论:1.MS和F.nucleatum均可以导致大鼠肠道菌群失调。2.MS可以引起大鼠明显的内脏高敏感,F.nucleatum可以通过非定植依赖的模式加剧MS大鼠内脏高敏感,并引起F.nucleatum特异性IgA增多。第三部分:具核梭杆菌编码的FomA蛋白通过肠嗜铬细胞参与肠易激综合征内脏高敏感的机制研究研究目的:EC细胞可以感受来自细菌成分及其代谢产物的刺激,并能够影响肠道代谢、动力和内脏感觉。FomA蛋白是F.nucleatum的主要外膜蛋白,是一种具有免疫佐剂功能的Toll样受体（Toll-like receptor,TLR）家族中TLR2受体的激动剂。第二部分的研究结果显示F.nucleatum可以加剧MS大鼠的内脏高敏感程度。并且先前我们在对一组已发表的转录组测序数据分析时发现,EC细胞含量最丰富的TLR受体即为TLR2受体。因此本部分研究主要探究FomA蛋白是否为F.nucleatum的主要作用蛋白,以及其是否可能影响EC细胞,并参与内脏高敏感的形成。研究方法:1.通过质谱分析、蛋白重组和Western blotting的方法,筛选并验证F.nucleatum可能与其特异性IgA结合的关键蛋白。2.根据罗马Ⅳ标准纳入IBS-D患者和健康对照者。留取纳入者结肠粘膜样本,通过免疫组化的方式检测结肠嗜铬粒蛋白A（ChgA,EC的通用标记物）,评估EC细胞表达情况。3.构建急性束缚应激（Acute restraint stress,ARS）小鼠模型,ARS造模的小鼠随后使用重组FomA蛋白阳性的大肠杆菌（E.coli BL21（DE3））或FomA阴性的E.coli BL21（DE3）进行连续7天灌胃,对照小鼠则接受生理盐水灌胃。4.灌胃结束后通过CRD实验进行AWR评分评估小鼠内脏高敏感程度。5.CRD实验结束后处死小鼠,留取结肠组织,使用免疫组化的方法检测结肠ChgA,评估EC细胞表达情况。6.提取小鼠结肠组织蛋白,通过Western blotting的方法检测小鼠结肠TLR2受体和TPH1蛋白表达情况。7.提取小鼠结肠RNA,逆转录获取cDNA,并通过实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR,qPCR）的方法检测小鼠结肠Tlr2、Tphl、Tnf-α、Tlr1、Tlr4 mRNA 水平相对表达量。研究结果:1.通过筛选验证显示FomA蛋白是F.nucleatum发挥作用的关键蛋白。2.免疫组化结果显示IBS-D患者结肠EC细胞数量较对照组显著增加（P<0.05）。3.通过CRD后的AWR评分来评估内脏敏感性发现,在0.1ml、0.15ml、0.2ml、0.25ml的AWR评分均具有显著的组间差异（P<0.05）,将上述体积得分总和记为内脏超敏指数进一步分析显示,接受FomA阳性E.coli BL21（DE3）灌胃的ARS小鼠内脏敏感程度显著高于接受FomA阴性E.coli BL21（DE3）灌胃的ARS小鼠（P<0.05）。4.对小鼠结肠组织EC细胞进行免疫组化染色显示ARS小鼠结肠粘膜组织EC细胞数量显著高于对照组（P<0.05）。5.通过Western blotting方法发现接受FomA阳性E.coliBL21（DE3）灌胃的ARS小鼠TLR2受体和TPH1表达量均显著升高（P<0.05）。6.通过qPCR扩增结肠组织cDNA,结果显示接受FomA阳性E.coli BL21（DE3）灌胃ARS小鼠结肠Tlr2、Tph1、TNF-α相对表达量均显著升高（P<0.05）,而Tlr1、Tlr4含量则无明显组间差异。研究结论:1.FomA蛋白是F.nucleatum发挥作用的关键蛋白。2.IBS-D患者结肠粘膜组织EC细胞数量增多。3.FomA蛋白可以激活结肠TLR2受体表达,并可以上调结肠EC细胞的数量和功能。