研究背景：皮肤作为最大的器官覆盖体表，不仅是内部组织和外部环境的物理屏障，在免疫系统中也执行重要生理功能，因此受损皮肤的缺损修复、功能重建极为重要。皮肤移植是治疗皮肤缺损，尤其是大面积缺损的主要手段。我国每年各类需要皮肤移植的患者高达320余万，全球范围市场更大。自体皮肤移植效果最好，但来源有限，面对巨大的供皮缺口，各国研究机构、企业均投入大量的人力物力予以研究开发，希望找到理想的解决方案。 要解决异体／异种皮肤移植问题，必须克服免疫排斥和供皮工程化生产两大技术难题。皮肤的结构分为表皮层、真皮层、和皮下组织，真皮组织的免疫原性很低，已有商品化真皮支架。表皮层主要由占93-97％的角朊细胞和少量树突状细胞(亦称郎格罕氏细胞)等组成，以往研究认为异体皮肤移植排斥的主要原因是由于供皮中的郎格罕氏细胞直接发挥抗原递呈作用，刺激受者淋巴细胞增殖。角朊细胞不表达共刺激分子CD80／CD86，无法提供淋巴细胞增殖过程中关键的共刺激信号，成为体外培养后进行移植的重要供皮来源，各种培养方法相继开发，已知的基本均取得专利，不可随意用于商业牟利。培养的角朊细胞膜片移植存活期虽较传统皮片延长，但最终供者细胞被完全排斥，具体机理不明，经典的考虑是受体抗原递呈细胞在发挥作用。 方法建立：为了研究移植过程中的免疫机理，本实验首先建立了乳鼠角朊细胞无血清培养方法，培养条件单纯，蛋白含量很低(＜25μg／ml)，最大限度减少了血乳鼠角脉细胞分离表达CD80/CD86及混合培养诱导免疫耐受机制的探讨清中混杂因素的干扰，辅以低钙浓度环境保证细胞的增殖活性和低分化潜能，设置10%胎牛血清培养作为不同培养方式的对照。建立的程序化实验步骤保证了试验体系稳定和批次间的一致性，最高重复10次的实验过程确保了实验数据的真实性和可重复性。现象发现:进一步的实验中，使用两种标准近交系小鼠(BALB/c，HZd和c57BL/6，H内，两种培养体系(无血清和有血清)，三个时间段(培养1天、4天、7天)，三种方法(流式细胞技术、激光共聚焦技术检测蛋白水平，Rl仁PCR检测mRNA表达)，7种荧光抗体，检测了角阮细胞在培养过程中经典的组织相容性复合体(MHC)I类、11类抗原，及共刺激分子CD80和CD86的表达。证实:培养的细胞中不含郎格罕氏细胞(因其高表达MHCn分子);角肮细胞表达MHCI类分子，但不表达MHCll类分子。首次发现乳鼠角阮细胞在培养过程中表达CD80，但不表达CD86，可刺激异基因淋巴细胞增殖，执行抗原递呈细胞功能。不同检测层面，多次重复数据证实了结果的真实性。角阮细胞一直被认为不表达CDSO和CD86，即使在丫干扰素刺激下也不表达，在过去的十余年间，不同的研究团队为了研究CD80在皮肤组织可能发挥的作用，大量采用转基因动物，使角阮细胞组成性表达共刺激分子CD80，很多研究结果发表在90年代中期的美国科学院学报上。本实验结果发现角阮细胞随培养时间的延长，逐渐表达CD80，不表达其他情况下常常伴生的CD86分子，证实角阮细胞分离表达CD80，且反证培养体系中无郎格罕氏细胞(其在培养过程中表达CD80和CDs6，甚至上调表达CD86分子)。以同种鼠骨髓来源的树突状细胞作阳性对照，高表达CDSO和CDS6，排除了试验体系的误差。机理解释:本研究结果为角阮细胞膜片移植排斥提出另一种可能的解释:Mr1CI类分子和CD80的表达，协同炎症环境中表达的MHCn类分子，使得培养的异体角阮细胞自身可兼具外来抗原和抗原递呈细胞的功能，刺激受体淋巴细胞增殖，实验中混合淋巴细胞反应证实了这一点。由此可见，要想完全解决供受体的免痉乳鼠角阮细胞分离表达CD80/CDs6及混合培养诱导免授耐受机制的探讨排斥问题，并非仅通过清除已知经典的抗原递呈细胞就可完成。 在20世纪免疫学的突出成就—共刺激信号通路中，CDSO和CD86被描述为表达于淋巴细胞上的CD28和CD152的共同配体，CD28激活提供刺激信号，CD 1 52激活提供抑制信号，但CDSO和CD86的作用并没有细化，常规认为在免疫反应中CD86先表达，CD80随后。2003年Sansom，DM.在Trends inln卫11unology等撰文提出了不同观点，构想了CD80先表达的模型。我们的实验结果支持后者，并在此基础上构想和细化了整个反应步骤:涉及CD80/C D86，CD 1 52/C D28在免疫细胞中表达时相的改变，结合力的变化以及和炎症反应之间的时效差异。假设探讨:皮肤移植另一个有趣的问题同角阮细胞的免疫原性有关。异体细胞膜片因可提前获得、允许基因改造和可以工程化生产备受关注。研究发现:异体/异种角阮细胞混合培养后移植能诱导局部免疫耐受，即使只有少量自体细胞，免疫反应也明显减弱，膜片存活得以延长。以往的机理研究认为是由于自体细胞的免疫抑制作用。我们的研究思路定位于两种角阮细胞在培养过程中发生的相互诱导，此条件下没有免疫细胞参与。发现不同比例的异体角阮细胞混合培养后，CD80的表达量明显改变，且这些改变和其刺激淋巴细胞增殖的程度相关联，同时这种关系受血清影响。此部分实验，我们从免疫排斥/耐受的始动环节一供受者抗原差异性对角阮细胞