脑卒中(stroke)作为急性脑血管疾病,具有高发病率、高致残率、高死亡率的特点。脑卒中具有出血和缺血两种发病原因,缺血性中风是其主要类型,其发病机制是脑部血管异常,导致血流不顺畅和组织供氧不充足。相对应的,其治疗机理是促进神经血管恢复,改善神经血管功能。缺血性脑卒中常常由血栓引起,血栓造成血管堵塞或血液流动不畅,引起组织供血、供氧不足,导致神经元及神经胶质细胞结构发生改变,从而引发机体的内源性神经修复,促使缺血性病变区周围组织中的神经前体细胞分化。而通过药物或细胞进行的神经修复治疗便是利用了神经可塑性,通过调节外界因素刺激来强化内源性的神经修复功能。缺血性脑卒中是影响神经功能的血管性疾病,由脑缺血引发炎症,增加脑微血管通透性,对神经元、支持神经元的星形胶质细胞和其他神经胶质细胞等产生直接影响。由于神经元和微血管对缺血性损伤的反应同样迅速,它们的相关性使我们开始关注神经元-星形胶质细胞-血管复合体,即神经血管单元(neurovascular unit,NVU)。NVU作为缺血性损伤更为有效的治疗目标,提示我们抗脑卒中的药物除了应具有神经保护的作用,还应具有血管保护的作用。在脑卒中的治疗方法中,中药相较于各种抗凝血和抗血小板药物具有更好的功效和更少的副作用。对于中药复方的研究,引入有效成分组的概念并进行相关实验可以更全面地认识药物的作用及机制。基于对脑卒中和中药复方的新认识,本文选取了卒中后临床使用的中药复方脑得生(Naodesheng,NDS)进行研究。脑得生(丸)由作为君药的三七,配伍川芎、红花、葛根及山楂组成,具有促进血液循环和祛瘀的作用。前期实验发现,通过高通量药物筛选实验获得的脑得生有效成分,按照对应比例混合组成新的有效的脑得生成分组(the effective components group of Naodesheng,NECG)对大鼠急性脑缺血有显著的防治作用。本文在此基础上,进一步研究了 NECG治疗性给药后对急性缺血再灌注大鼠的神经恢复的作用及机制。一、脑得生有效成分组促进急性脑缺血再灌注大鼠神经功能恢复本章通过利用wistar大鼠,构建短暂性大脑中动脉阻塞模型。在缺血2 h后,拔出线栓,实现再灌注。再灌后22 h开始灌胃给药,除假手术组(sham)外,模型成功的大鼠随机分配为6组:模型组(model)、NECG高剂量组(NECG 0.07 g/kg)、中剂量组(NECG 0.02 g/kg)、低剂量组(NECG 0.007 g/kg)、金纳多组(EGb 761 0.15 g/kg)、脑得生片组(NDS pian 1.075 g/kg),每天给药一次,持续给药14天。给药期间进行动物体重测量、死亡率计算、行为学评估等,于给药结束后处死大鼠,进行脑损伤体积检测、免疫组化染色等,以评价NECG促进急性脑缺血再灌注大鼠的神经功能恢复作用,并进行机制研究。结果显示,NECG高剂量组(NECG 0.07 g/kg)可以促进大鼠的体重恢复,低剂量组(NECG 0.007 g/kg)可以在实验早期降低卒中模型大鼠死亡率,中剂量组(NECG 0.02 g/kg)可以维持模型大鼠长期存活,并在mNSS、Berderson、改良贴纸去除实验中有最佳的促神经功能恢复作用,同时可以降低脑损伤体积,并通过促进树突、髓鞘等的生成,从而促进神经元新生;通过减少对神经元的伤害,从而减轻了由脑缺血引起的神经功能损伤。综上,NECG中剂量治疗的效果明显好于阳性药金纳多,并优于脑得生片。结果表明,NECG对脑缺血动物的保护作用并不低于甚至优于原方,且给药剂量明显降低。NECG具有促进tMCAO大鼠神经功能恢复的作用,同时降低了 tMCAO大鼠的脑损伤和死亡率。二、脑得生有效成分组促进急性脑缺血再灌注大鼠脑血管新生本章分别在构建完成的tMCAO大鼠体内模型上探究上述各组药物促血管新生作用,并于tMCAO大鼠的颈总动脉外植体模型上探究体外NECG-L(1 μg/mL)、NECG-M(10μg/mL)、NECG-H(100μg/mL)、金纳多(10μg/mL)、脑得生片组(10 μg/mL)促血管新生的作用,并于体外内皮细胞模型上加以验证。结果显示,在动物体内实验上,NECG中剂量组(NECG 0.02 g/kg)通过促进血管生成相关因子、蛋白的表达,从而促进血管生成;通过增加闭合蛋白的表达,从而调节上皮细胞的极性,减轻脑缺血引起的损伤;在颈总动脉外植体上,NECG 10 μg/mL和100 μg/mL剂量组促使细胞分化,生成血管;在内皮细胞系及原代细胞上,NECG 10 μg/mL剂量组可促进微管状细胞生成,其促进血管生成的作用明显优于空白对照组,且优于金纳多。综上可知,NECG在细胞、组织、整体水平皆具有促血管生成的作用。三、脑得生有效成分组主要成分分离及神经血管保护作用的网络药理学研究本章分别运用化合物分离制备技术和网络药理学方法,对NECG物质基础进行探讨,并在细胞水平加以验证,来进一步分析脑得生有效成分组的作用机制和药效物质基础。1.膏体净重计算本实验使用的NECG是由本所陈若芸研究员实验室制备的膏体,冷藏储存。由于其为膏体,其中含有非药物的溶剂残留成分,故在定量实验前需要计算膏方中的药物比重,即:通过旋转蒸干方法计算药物含量。最终所获得的结果为:脑得生30%乙醇提取物的药物比重为84.76%,脑得生60%乙醇提取物的药物比重为78.59%。实验所用的药物称重皆按照该比例进行换算。2.指纹图谱分析利用安捷伦液相色谱仪,在TSK gel ODS-100S反相色谱柱、280 nm检测波长、及流动相为乙腈等洗脱条件下进行色谱分析。实验结果显示,脑得生30%乙醇提取物和60%乙醇提取物的分离色谱图的出峰区域与实验室之前的相关研究结果基本一致。选择脑得生复方药材中具有代表性的单体,用甲醇配制50 μg/mL的溶液,于上述相同条件下进行色谱分析,构建指纹图谱。再通过光谱法验证30%乙醇提取物和60%乙醇提取物相应的吸收峰。最终,利用上述11种单体的信息,在乙醇提取物上分别识别出两种物质,确证了 NECG中的部分功效成分,为后续物质基础分析提供色谱信息。3.基于网络药理学的神经血管保护作用采用分子对接和网络药理学等生物信息学方法,构建反映脑得生潜在作用机制的“药材成分—疾病靶点”网络。首先,通过文献研究,筛选了五种药材的主要成分来构建分子库;其次通过查找脑卒中的治疗策略,筛选最具代表性的靶点构建靶点库;然后通过Discovery Studio 4.1进行Libdock分子对接。最后将对接结果进行统计分析,并同脑得生部分单体于hcmec/d3细胞上完成的增殖实验结果进行比较。从而在网络药理学水平上探讨脑得生部分成分的神经血管保护作用及机制研究,为中药脑得生有效成分组的研究奠定了基础。综上所述,本论文在成功构建tMCAO模型的wistar大鼠上,进行了体内NECG治疗脑卒中的药理学研究和药效学评价,发现NECG通过促进突触、突起、髓鞘等的生成,从而促进神经元新生;通过减轻神经元受到的损伤,从而降低脑缺血引起的神经功能受损;通过促进血管生成相关因子、蛋白的表达,从而具有促血管生成的作用;通过增加闭合蛋白的表达,从而调节上皮细胞的极性,减轻脑缺血引起的损伤。总之,NECG相较于原方,可以在更低的剂量水平实现治疗脑卒中的目标。而之后通过膏体净重计算、指纹图谱分析和基于网络药理学进行的神经血管保护作用分析,可以进一步在虚实结合的方面进行脑得生的物质基础研究。本研究将为脑得生及其他中药复方基于神经恢复和血管新生功能的脑卒中治疗提供研究基础和新思路。