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实验目的近年来,黑茶在茶叶市场中占有的份额越来越高,也得到了消费者的一致好评,原因主要有两方面,一方面是黑茶的独特口感和优良品质,另一方面是其具有很好的保健功能。黑茶的保健功效主要有降脂、抗氧、抗癌和调节肠道免疫功能等。随着全球癌症发病率的不断攀升,抗癌作用已成为黑茶功能研究的热点。我省有着丰富的安化黑茶资源,研究安化黑茶提取物的抗癌功能可以极大地提高其附加值,本实验以结直肠癌细胞作为实验模型,对安化黑茶的抗癌功能进行评估并探讨其作用的分子机理,为日后人们的饮食、功能性食品、保健产品的开发提供理论依据。实验方法本课题拟从黑茶提取物抑制结直肠癌细胞增殖和促使结直肠癌细胞凋亡两个方面对黑茶抗癌功能进行评估。利用MTS方法,分析安化黑茶提取物对结直肠癌细胞HCT116增殖的影响;利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析黑茶提取物对癌细胞相关基因表达的影响;采用报道基因系统确定黑茶提取物对转录因子AP-1和NF-κB活性的影响;采用磷酸化抗体分析黑茶提取物对MAPK信号通路的影响等。通过HOechst33258荧光染色法分析黑茶提取物对结直肠癌细胞调亡的影响,确定其对细胞形态、细胞核的变化;通过流式细胞技术进一步分析安化黑茶提取物对结直肠癌细胞调亡的影响;采用Western blot方法,分析安化黑茶提取物对Bcl-2家族蛋白和Caspase活化的影响。阐明安化黑茶提取物抑制直肠癌细胞增殖和促进凋亡的分子机理。实验结果(1)安化黑茶提取物对结直肠癌细胞增殖具有抑制作用。本课题首先采用MTS细胞存活实验分析了安化黑茶提取物对结直肠癌细胞HCT116增殖的影响,采用0 μg/mL、100 μg/mL、200μg/mL和400μg/mL浓度安化黑茶提取物作用48 h后,发现安化黑茶提取物能抑制HCT116的增殖活动,且随着浓度增大,抑制作用增强。(2)安化黑茶提取物能调控细胞周期关键靶基因的表达安化黑茶提取物处理结直肠癌细胞,提取总RNA,通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)发现,安化黑茶提取物能抑制细胞周期关键靶基因cyclinD1和VEGF的mRNA表达水平,且呈剂量依赖性的关系。细胞周期素依赖的蛋白激酶抑制子(CDKI)与癌细胞的增殖密切相关。实验发现安化黑茶提取物对p16、p21、p27和p53均具有明显的提升作用,且呈剂量依赖性,提示安化黑茶提取物能抑制CDK2/CDK4/CyclinD复合物的活性,抑制结直肠癌细胞的增殖。但安化黑茶提取物对p15、p18和p19的表达没有影响。(3)安化黑茶提取物对结直肠癌细胞AP-1和NF-κB转录活性的影响转录因子AP-1和NF-κB在癌的发生、发展中起非常重要的作用。在P16、p21、p27、p53、cyclinD1和VEGF等基因的启动子区域,均存在AP-1和NF-κB的DNA结合位点,AP-1和NF-κB是调控CDKI基因表达的重要转录因子,同时,也是cyclinD1基因的表达的主要调控因子。将带有荧光素酶的AP-1和NF-κB报道质粒通过Lipofectamin 2000导入HCT116细胞,不同安化黑茶提取物处理结直肠癌细胞后,检测荧光酶的活性,结果发现安化黑茶提取物既能抑制转录因子AP-1的活性,也能抑制转录因子NF-κB的活性,提示安化黑茶提取物可能通过抑制AP-1和NF-κB的转录活性,从而下调对cyclin D1和VEGF等表达,提升对p16、p21、p27和p53等的表达。(4)安化黑茶提取物对结直肠癌细胞MAPK信号通路的影响MAPK信号通路是癌细胞中异常活化的信号通路,与癌细胞的增殖和凋亡密切相关。转录因子AP-1和NF-κB是MAPK下游激活的靶蛋白,如JNK能直接活化c-Jun,从而激活AP-1。不同安化黑茶提取物处理结直肠癌细胞后,提取总蛋白Western blot分析发现,安化黑茶提取物能抑制ERK1/2和JNK的磷酸化,且呈剂量依赖性的关系;相反,安化黑茶提取物能促使P38MAPK的磷酸化。结果提示安化黑茶提取物能抑制癌细胞增殖的信号通路,同时,也能激活与癌细胞凋亡相关的信号通路。(5)安化黑茶提取物促进结直肠癌细胞凋亡不同浓度的黑茶提取物处理结直肠癌细胞后,结果发现,低浓度的黑茶提取物不能导致结直肠癌细胞HCT116凋亡,高浓度黑茶提取物能显著促进结直肠癌细胞凋亡,在荧光染色实验中发现有细胞核凝集、浓缩、核碎裂,出现凋亡小体等,通过流式细胞仪进一步证实黑茶提取物能促进结直肠癌细胞凋亡。(6)安化黑茶提取物对结直肠癌细胞凋亡相关基因表达的影响Bcl-2超家族对于维持细胞的稳态非常重要,Bcl-2超家族既包含有促细胞调亡的蛋白如Bax,也包括抑制细胞调亡的蛋白如Bcl-2。不同浓度的黑茶提取物处理结直肠癌细胞后,Western blot分析发现黑茶提取物能促进Bax基因表达,同时,抑制Bcl-2基因表达,黑茶提取物打破了 Bax/Bcl-2比例,促进结直肠癌细胞凋亡,导致Caspase-3活化。结论:基于以上实验研究,本课题确定了安化黑茶提取物能抑制结直肠癌细胞增殖,其分子机理:安化黑茶提取物→MAPK表达↓→AP-1、NF-κB↓→cyclinD1↓、VEGF↓、CDKI表达↑→细胞周期阻滞→抑制癌细胞增殖。本课题确定了安化黑茶提取物能促进结直肠癌细胞凋亡,其可能的分子机理:安化黑茶提取物→Bcl-2表达↓、Bax表达↑→Caspase-3活化→结直肠癌细胞凋亡。