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喹烯酮是我国自主研发的一类新兽药,其作为饲料添加剂广泛应用于畜牧水产养殖的生产实践中,具有良好的抗菌促生长作用。上世纪九十年代一系列的常规毒理试验证明了喹烯酮作为饲料添加剂的安全性。但是进入新世纪后,食品安全的重要性越来越受到关注。喹烯酮属于喹噁啉类化合物,同一类中还包括喹乙醇、卡巴氧等。喹乙醇和卡巴氧都被证实具有显著的毒性,与其拥有相同核心结构的喹烯酮的安全性也受到了重新审视。最近本实验室对喹烯酮引起的细胞凋亡及其通路进行了研究,对喹烯酮引起细胞的死亡机制有了初步了解。本研究拟从细胞程序性死亡的角度对喹烯酮作用下细胞死亡的分子机制做进一步的探索。试验结果表明喹烯酮与ML-7联用时,对HepG2细胞毒性增加,细胞凋亡率进一步升高,线粒体膜电位消失的效应增强,外源性和内源性凋亡通路都更加被激活。以上结果表明,喹烯酮通过凋亡引起细胞死亡的过程可以被ML-7加强。进一步研究表明,ML-7刺激了喹烯酮引起的MAPKs信号通路,同时抑制了喹烯酮引起的Akt信号通路。并且,运用MAPKs抑制剂和Akt激动剂之后的试验结果表明,Akt通络和MAPKs通路都参与了喹烯酮引起的细胞凋亡。综上所述,喹烯酮可以通过Akt通路和MAPKs通路调控凋亡的发生,具体机制为喹烯酮通过p38来诱发凋亡,而ERK, JNK和Akt通路则在此过程中抑制凋亡的发生。自噬又被称为细胞Ⅱ型程序性死亡,GFP-LC3质粒转染喹烯酮处理的HepG2细胞发现,喹烯酮使细胞中LC3聚集点增多,LC3的转化率呈喹烯酮浓度依赖性和时间依赖性升高。结果表明喹烯酮引起了HepG2细胞发生自噬。接着,研究发现内质网应激蛋白BiP和CHOP的表达量呈喹烯酮时间依赖性和浓度依赖性升高,并且sec24D、HerpUD、BiP的转录活性呈喹烯酮浓度依赖性升高。结果表明喹烯酮引起了HepG2细胞内的内质网应激。进一步研究发现,喹烯酮处理后,通过ATF6/DAPK1/MRLC的级联反应使mAtg9a的转移加强,从而促进了自噬小体的生成。在干扰掉ATF6和DAPK1后,自噬标志蛋白LC3的转化率随之降低。综上所述,喹烯酮通过引起内质网应激诱导了自噬通量的上升。线粒体自噬是一种具有底物特异性的选择性自噬。本研究结果表明,线粒体自噬的核心调控蛋白parkin和PINK1在喹烯酮作用的HepG2细胞中呈浓度依赖性和时间依赖性降低；。线粒体膜蛋白COX IV蛋白表达降低、Tom20和Tim23的蛋白表达升高,与阳性对照CCCP产生的蛋白变化相同。结果表明,喹烯酮处理下的HepG2细胞发生了线粒体自噬。对线粒体自噬受体的western blot检测显示,在喹烯酮作用下OPTN变化不显著,而TAX1BP1、FUNDC2表达量显著升高。但是,在CCCP的作用下OPTN显著升高,TAX1BP1显著降低,FUNDC2变化不明显。结果表明,喹烯酮作用下的HepG2细胞中线粒体自噬受体的变化趋势与典型的线粒体自噬有很大不同。进一步的试验运用parkin-Flag高表达质粒转染HepG2细胞。结果显示,喹烯酮和CCCP对parkin-Flag蛋白量都有显著抑制。转染质粒后HepG2在喹烯酮和CCCP处理下的线粒体膜蛋白和自噬相关蛋白的变化趋势都进一步加强。并且,喹烯酮和CCCP都引起了HepG2细胞线粒体膜电位降低。但是,CCCP使HepG2细胞的线粒体数量显著下降,而喹烯酮对线粒体数量的影响并不显著,parkin转染对结果影响也不明显。结果表明,虽然喹烯酮能使线粒体膜电位下降,但是对线粒体数量没有明显影响。综上所述,喹烯酮对线粒体的损伤作用虽然启动了HepG2细胞中的线粒体自噬,但是并没能造成线粒体数量的减少。从以上研究中可以得出结论,喹烯酮能引起HepG2细胞发生凋亡、自噬通量升高、以及线粒体自噬的起始。证明程序性细胞死亡在喹烯酮的毒性作用中发挥了重要作用。