目的:小檗碱(Berberine,BBR),又称黄连素,是从传统用于治疗肠炎、痢疾中药黄连、黄柏等中分离得到的一种异喹啉类生物碱。小檗碱具有广泛的应用,特别是在胃肠炎、腹泻、痢疾等肠道感染性疾病治疗方面疗效显著。研究发现小檗碱具有抗炎、抗肠炎、抗菌、抗肿瘤等多种药理活性,被作为一种极具应用潜力的“万能药”,被推向中药单体开发的前茅,近年来广受关注。但小檗碱口服后,生物利用度不足1%,其药理作用机制目前还不十分明确,存在着较大的争议。研究认为,小檗碱体内代谢物,特别是肠道代谢物是小檗碱发挥药理作用的活性形式。小檗碱口服后,肠道菌群通过还原、甲基化、脱甲基化、脱羟基化等反应.介导小檗碱代谢为二氢小檗碱、小檗红碱、去亚甲基小檗碱、药根碱等,但这些代谢物较原药小檗碱药理活性不显著,难以说明小檗碱广泛而显著的药理活性机制,提示存在其它代谢方式产生活性更强的代谢产物。目前未见氧化反应代谢产物及药理活性的报道。本课题首次发现肠道微生物可通过氧化反应将小檗碱代谢转化为氧化小檗碱(Oxyberberine,OBB)。据报道,相较于小檗碱,氧化小檗碱具有更强的抗真菌、抗肿瘤和抗心律失常活性。基于小檗碱具有抗炎和抗溃疡性结肠炎活性,临床上普遍用于防治胃肠炎、痢疾等肠道感染性疾病,本课题拟探讨小檗碱肠道代谢物氧化小檗碱抗炎及抗溃疡性结肠炎的活性及作用机制,为黄连及小檗碱治疗腹痛、泄泻、痢疾等的传统应用提供科学依据,并为新型抗UC先导物的研究与开发提供支撑。方法:1.肠道微生物对小檗碱的代谢转化首先,采用正常SD大鼠/KM小鼠的新鲜粪便以及6种单一肠道菌株与小檗碱在37℃厌氧条件下孵育24 h,采用柱层析分离、制备主要代谢产物,并应用LC-MS-MS和NMR分析技术,鉴定并分析小檗碱肠道代谢物的化学结构和含量。其次,口服小檗碱24 h内,在正常SD大鼠/KM小鼠粪便中检测并鉴定代谢产物。最后,采用口服抗生素方法建立了伪无菌SD大鼠/KM小鼠模型,并在伪无菌老鼠上,研究小檗碱口服后,在体内的代谢转化,以验证肠道菌群对代谢物含量的影响。2.氧化小檗碱抗炎作用的研究采用LPS刺激RAW264.7巨噬细胞模型,比较小檗碱及其肠道菌氧化、还原代谢产物氧化小檗碱和二氢小檗碱的抗炎活性;通过二甲苯致小鼠耳廓肿胀模型、醋酸致小鼠毛细血管通透性模型和角叉菜胶致大鼠足肿胀模型三种典型的急性炎症小鼠模型评价氧化小檗碱的抗炎药效。通过Elisa,qRT-PCR和Western印迹分析TNF-α、IL-6、IL-1β等炎症相关分子的水平和表达。3.氧化小檗碱抗溃疡性结肠炎作用及机制研究SPF级雄性BALB/c小鼠,自由饮用3%DSS水溶液8天后,诱导溃疡性结肠炎模型。模型建立的同时各组小鼠给予相应的药物:氧化小檗碱(12.5、25、50 mg/kg)、小檗碱(50 mg/kg)和硫唑嘌呤(13 mg/kg),持续给药8天进行治疗,其中正常组、模型组则给予治疗药物的相应溶剂(2%Tween-80水溶液)。通过观察氧化小檗碱对DSS诱导的溃疡性结肠炎模型小鼠一般症状(体重变化、便血、稀便、疾病活动评分(DAI)及结肠长度变化)和结肠组织病理学变化的影响,评价氧化小檗碱对DSS致小鼠溃疡性结肠炎的治疗作用。然后,运用以下多种技术和方法,探讨氧化小檗碱对DSS致小鼠溃疡性结肠炎的保护机制:MPO试剂盒方法测定结肠组织MPO的含量;Elisa技术检测血清中免疫球蛋白(IgA、IgG和IgM),结肠组织中炎症因子(TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10、IL-17和IFN-γ)的含量;qRT-PCR技术检测结肠组织中黏蛋白mucin-1和mucin-2的基因表达;Western blot检测结肠组织中TLR4-MyD88-NF-κB信号通路蛋白(TLR4、MyD88、NF-κB p65、p-IκBα 和 IκBα)及肠屏障蛋白(ZO-1、ZO-2、JAM-A、Claudin-1和Occludin)的蛋白表达情况;16s rDNA高通量测序对粪便样品进行测序后,通过OUT统计分析、物种丰度分析、聚类分析等,研究氧化小檗碱对DSS致UC小鼠肠道微生物多样性和菌群结构等的调节作用。结果:1.肠道微生物对小檗碱代谢转化 LC-MS-MS结合NMR谱图结果显示,小檗碱在正常大鼠/小鼠、伪无菌大鼠/小鼠体内外肠道菌群作用下,均可代谢转化为氧化小檗碱。正常SD大鼠和KM小鼠的肠道菌群对氧化小檗碱的转化率分别为12.42%和17.03%。口服小檗碱后,24 h内粪便肠道菌群代谢物氧化小檗碱,在正常SD大鼠和KM小鼠的含量分别为1.49%和1.75%(占口服给药量百分比),且在伪无菌SD大鼠和KM小鼠模型上,氧化小檗碱的含量显著降低,含量分别为0.05%和0.21%(占口服给药量百分比)。此外,6种单一肠道菌株(有益菌:双歧杆菌、醋酸菌;中间菌:粪链球菌、大肠埃希菌;有害菌:铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌)均具有代谢转化小檗碱为氧化小檗碱的作用,其中中间菌中的粪链球菌转化量最多。2.氧化小檗碱抗炎作用的研究 MTT法检测小檗碱、氧化小檗碱和二氢小檗碱对RAW264.7细胞的活力,结果表明三者对RAW264.7细胞的安全性顺序为氧化小檗碱>小檗碱>二氢小檗碱。LPS诱导的RAW264.7细胞体外炎症模型中,小檗碱、氧化小檗碱和二氢小檗碱(1.25、2.5和5μM)预处理以剂量依赖的方式显著降低TNF-α、IL-1β和IL-6的水平。此外,real-time PCR结果也表明氧化小檗碱、小檗碱和二氢小檗碱能显著抑制COX-2和iNOS的基因表达,从而减少RAW264.7细胞中PGE2和NO的含量,三者抑制强度为氧化小檗碱>小檗碱>二氢小檗碱。免疫印迹结果表明,氧化小檗碱、小檗碱和二氢小檗碱显著抑制NF-κB p65和IκBα的磷酸化。小鼠急性毒性试验结果表明,氧化小檗碱的半数致死量(LD50)值大于5243.6 mg/kg,远大于二氢小檗碱(LD50值为503.80 mg/kg),表明氧化小檗碱具有较高的安全性。同时,氧化小檗碱(5、10、20mg/kg)、小檗碱(20 mg/kg)和二氢小檗碱(20 mg/kg)预处理均能显著抑制二甲苯诱导的小鼠耳肿胀,降低醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性增强以及抑制角叉菜胶诱导的小鼠足肿胀且氧化小檗碱的抑制率呈剂量依赖性。三者抑制肿胀的作用效果顺序为:氧化小檗碱>小檗碱>二氢小檗碱。组织病理学分析表明,氧化小檗碱、小檗碱和二氢小檗碱能明显减轻炎性病变,减少足组织炎症细胞浸润。进一步机制研究表明,氧化小檗碱、小檗碱和二氢小檗碱显著降低了角叉菜胶诱导的足组织中促炎细胞因子TNF-α IL-1β和IL-6,增加了抗炎细胞因子IL-10的分泌及mRNA表达。此外,氧化小檗碱、小檗碱和二氢小檗碱明显下调COX-2和iNOS的基因表达进而减少PGE2和NO的含量。3.氧化小檗碱抗溃疡性结肠炎作用及机制研究在DSS致小鼠溃疡性结肠炎(UC)模型中,不同剂量的氧化小檗碱(12.5、25、50 mg/kg)给药后均能改善模型小鼠体重减轻、稀便、血便、结肠缩短以及结肠组织上皮屏障破坏和炎性浸润等情况,同时降低DAI指数。氧化小檗碱中剂量组(25 mg/kg)抗UC作用与阳性药硫唑嘌吟(13 mg/kg)相当,优于小檗碱(BBR,50 mg/kg)。进一步机制研究发现,氧化小檗碱给药后显著增加黏蛋白mucin-1和mucin-2的mRNA表达,并明显增加紧密连接蛋白(ZO-1、ZO-2、JAM-A、Claudin-1和Occludin)的表达,以保护肠黏膜屏障功能,减轻DSS诱导的结肠组织上皮屏障破坏。同时,氧化小檗碱处理组显著抑制DSS致小鼠溃疡性结肠炎模型中炎症细胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17、IFN-γ和IL-10)的水平,降低血清中免疫球蛋白如IgA、IgG和IgM的含量,并明显下调TLR4和MyD88的蛋白表达,抑制IκB的磷酸化,控制炎症过程中NF-κB p65从细胞质移向细胞核,从而抑制TLR4-MyD88-NF-κB信号通路的激活,调节炎症,免疫功能以改善肠黏膜炎症及病理损伤。此外,肠道菌群特定种属数量分析结果表明氧化小檗碱显著增加了优势菌群拟杆菌门,拟杆菌属和普雷沃菌属的相对丰度,并显著抑制DSS诱导的UC小鼠中厚壁菌门、梭菌属、粪芽孢菌属、低嗜盐细菌属、副拟杆菌属、普氏菌属、瘤胃球菌属及葡萄球菌属的相对丰度;主成分分析(PCA)、主坐标分析(PCoA)和聚类分析结果显示氧化小檗碱明显逆转DSS诱导UC所致小鼠肠道微生物群组成变化,说明氧化小檗碱可明显改善DSS诱导的菌群失调,使失调的菌群恢复至正常水平。结论:1.通过体内和体外肠道微生物对小檗碱的代谢研究,发现小檗碱可被代谢转化为氧化小檗碱,其转化率可能与肠道菌群结构差异、菌株差异等因素相关。2.通过比较小檗碱及肠道菌群介导的小檗碱氧化、还原代谢产物氧化小檗碱和二氢小檗碱的体内外抗炎实验,发现三者具有明显抗炎疗效,强度顺序为氧化小檗碱>小檗碱>二氢小檗碱;机制可能与抑制NF-κB信号通路,进而下调促炎细胞因子,上调抗炎细胞因子水平有关。3.发现氧化小檗碱具有明显保护溃疡性结肠炎作用,药效与阳性药硫唑嘌呤相当,优于小檗碱;机制可能与保护肠黏膜屏障功能,抑制炎症和免疫球蛋白水平,调节肠道菌群结构有关。综上所述,肠道微生物与药物之间可发生相互作用,进而改变药物的结构和药效。小檗碱肠道菌群代谢产物—氧化小檗碱,可能是湿热痢疾要药黄连及其主成分小檗碱,用于治疗肠道炎症疾病的药效活性物质。本研究将有助于了解肠道菌群和药物作用机制之间的关联性,阐明小檗碱的药效学活性物质,并为开发氧化小檗碱为一种安全、有效的治疗UC的天然先导化合物提供证据。此外,本研究揭示小檗碱具有天然前体效应物属性,对其活性呈现的肠道机制进行研究,有助为阐释生物利用度低而活性高的中药成分显效机理提供新的视角和范例。