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奶牛乳房炎是由各种病因引起的乳房炎症,它造成的经济损失非常巨大。尽管各国兽医工作者多年来对该病的预防与治疗研究付出了极大的努力,但仍无满意的结果,至今仍以抗生素治疗为主。由于抗生素残留和耐药菌株的出现造成奶品质下降和治疗困难,所以迫切需要研究新的预防与治疗方法。病原学调查表明,金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus S.A)是引起奶牛乳房炎的主要病原因子,而目前只有大肠杆菌的研究取得成功,保护率达到85%。但有关葡萄球菌属,尤其是金黄色葡萄球菌相关疫苗少见,因此,目前迫切需要对葡萄球菌菌苗的进行研究,以期能够投入临床,造福社会。传统的灭活疫苗和弱毒苗效果不理想,因此本研究利用基因工程方法,克隆并原核表达了奶牛乳房炎主要致病性葡萄球菌的抗原基因---黏附因子clfA、FnBP,为进一步研究奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌在乳腺组织(乳导管)的黏附、定植生长及FnBP和clfA两个基因一起协同作用感染家畜的分子生物学机制提供了理论依据,同时也为开发奶牛乳房炎基因工程疫苗及其佐剂的研制提供了新的思路和方向。本实验从动物源(奶牛)身上分离得到金黄色葡萄球菌,再从金黄色葡萄球菌中筛选得到耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin Resistant Staphylococcus Aureus,MRSA),重组表达金黄色葡萄球菌FnBP、clfA基因,为进一步免疫学研究提供目标蛋白,并且为研究治疗奶牛乳房炎用药提供了理论依据,从而为DNA疫苗等的研发提供了方向。按常规方法复苏菌株,用血浆凝固酶试验重新鉴定SA。用KB法、琼脂筛选法、生化鉴定法(VITEK32)、聚合酶链式反应等法鉴定MRSA。经常规鉴定的葡萄球菌105株,金黄色葡萄球菌(SA) 62株,MRSA 13株占金黄色葡萄球菌(SA)的20.10%,2株未确检。用PCR的方法从金黄色葡萄球菌(C2694)的基因组DNA中扩增出FnBP、clfA基因,用T/A克隆法将其插入pGM-T载体,并构建原核表达载体pET-28a(+)-FnBP/clfA。用BL21(DE3)/pET系统表达Trix- FnBP/clfA融合蛋白,SDS-PAGE和Western blot分析鉴定表达产物。PCR扩增产物经测序,证实与GenBank中金黄色葡萄球菌FnBP基因(J04151)序列同源性为100%,clfA基因(AB245457)序列同源性为95.69%。。SDS-PAGE显示,经IPTG诱导后BL21(DE3)/pET-28a(+)-FnBP/clfA总蛋白中出现一条相对分子质量为58kDa/45 kDa的新蛋白带。Western blot分析显示, FnBP、clfA蛋白均可与金黄色葡萄球菌多克隆抗血清发生特异性反应。新疆兵团部分垦区牛场乳房炎奶样中MRSA已经呈蔓延趋势,在患该病的病畜奶样中检出MRSA检出率达到12.38%。本实验成功表达了融合蛋白FnBP和clfA,为FnBP、clfA基因在细菌致病中的作用以及相关疫苗的研究奠定了基础。