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背景：冠状动脉粥样硬化性心脏病是严重威胁人类健康的一类疾病,其主要病理改变是血管的粥样硬化斑块的形成及破裂。研究表明干细胞,特别是间质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)可能通过一系列机制参与斑块的发生发展：MSCs具有迁移的能力,能在相应诱因的刺激下进入血管壁。血管壁中的MSCs能抑制血管壁平滑肌细胞(smooth muscle cells, SMCs)的增生和迁移。MSCs与成熟的内皮细胞(endothelial cells, ECs)共培养能分化为内皮细胞。这些都提示MSCs可抑制动脉粥样硬化斑块的发生发展,即：一方面可以抑制平滑肌细胞的分化,抑制粥样斑块的发展；另一方面也可以分化为内皮细胞,修复内膜的损伤。直接的证据也显示,在动脉粥样硬化小鼠模型中,移植的髓细胞能迁移进入斑块,而来自低龄小鼠的髓细胞移植后模型的动脉粥样硬化程度较低。然而,MSCs也具有促粥样硬化的作用,体外培养的MSCs能分化为SMCs,并且MSCs来源的平滑肌祖细胞在氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein, ox-LDL)的作用下,可以分化为泡沫细胞。值得注意的是,骨髓间质干细胞作为心脏疾病细胞移植的供体细胞而在临床细胞治疗和基础研究中受到广泛关注。因此,冠心病的危险因素作用下骨髓间质干细胞的病理生理变化值得进一步研究。高血脂作为冠心病的主要危险因素之一,参与粥样硬化斑块从开始形成到破裂的整个过程,其升高程度与冠心病患者的预后直接相关。血脂中对血管产生毒性作用的主要成分为低密度脂蛋白,特别是其中的ox-LDL,研究表明,在冠心病患者血浆ox-LDL浓度明显升高,急性冠脉综合征患者其水平更高。Ox-LDL具有致动脉粥样硬化作用,包括诱导粘附蛋白表达以及其促进其进入单核细胞内,形成泡沫细胞和脂质条纹,诱导平滑肌细胞迁移和增生,改变细胞外基质成分,使动脉张力调节紊乱。到目前为止,相比分化程度更高的内皮祖细胞及平滑肌祖细胞,目前关于ox-LDL对骨髓间充质干细胞(bone-marrow mesenchymal stem cells, BMSC)生存、增殖及生理功能的研究较少。Ox-LDL对靶细胞的作用主要机制在于膜受体介导的吞噬作用,其中血凝素样氧化低密度脂蛋白受体1(lectin-like oxidized low-density lipoprotein receptor, LOX-1)是研究的热点之一。在细胞内,ox-LDL可抑制Aktl表达,进而抑制下游基因内皮一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide syntheis, eNOS)、使一氧化氮合成减少,细胞内氧化应激水平升高,细胞迁移、增殖受抑制。而最近在肿瘤细胞中发现另一种Akt的异构体Akt2,与Aktl的作用完全相反,在MSCs中也发现Akt2激活后能促进细胞的迁移。但是目前MSCs中ox-LDL对2种Akt异构体的作用差异未见报道。微小RNA let-7g作为第二个发现的微小RNA let-7家族的成员,最近研究表明在SMC胞中let-7g可调节LOX-1表达,改变靶细胞对ox-LDL的吞噬。但在MSCs中其作用尚不明确。因此,本文拟探讨ox-LDL对BMSCs增殖、迁移的影响及其作用机制是否与let-7g/LOX-1-Akt信号通路相关,同时探讨其对MSCs凋亡的影响。目的：观察ox-LDL对BMSCs增殖、迁移、凋亡的影响及相关的作用机理。方法：原代提取C57BL/6小鼠BMSCs分别进行以下实验：(1)细胞生长曲线测定；(2)流式细胞术细胞表面抗原CD29、CD31、 CD34、D45测定；(3)MSCs成脂分化；(4)Annexin-V/PI检测ox-LDL对MSCs凋亡的影响；(5) TUNEL检测ox-LDL对MSCs凋亡的影响；(6)ELISA检测MSCs对ox-LDL的吞噬；(7)观察ox-LDL作用后MSCs中微小RNA let-7g及膜受体LOX-1表达的变化；(8)观察let-7g类似物或LOX-1单抗对MSCs吞噬ox-LDL的影响；(9)观察ox-LDL作用后MSCs增殖、迁移能力的改变；(10)观察ox-LDL作用后MSCs中Akt2、MMP-2、Akt1、eNOS表达的变化；(11)观察let-7g类似物或LOX-1单抗对ox-LDL诱导的MSCs增殖、迁移的影响。结果：1、流式细胞鉴定BMSCs表面抗原表达情况为CD29+CD31-CD34-CD45-,细胞具有成脂分化能力；2.0-40μg/ml ox-LDL不显著诱导BMSCs凋亡；3、LOX-1、let-7g在MSCs中有表达,ox-LDL干预后LOX-1表达上升、let-7g表达下降；4. MSCs能吞噬ox-LDL, LOX-1单抗或let-7g类似物能抑制MSCs对ox-LDL的吞噬；5. Ox-LDL诱导BMSCs增殖和迁移,上调Akt2、MMP-2表达,下调Akt1、eNOS表达；LOX-1单抗或let-7g类似物能抑制ox-LDL诱导的BMSCs增殖和迁移。结论：1、Ox-LDL能被小鼠BMSCs吞噬,诱导MSCs增殖和迁移,对MSCs凋亡无明显影响；2. Ox-LDL诱导的小鼠BMSCs增殖和迁移与let-7g/LOX-1-Akt2信号通路相关第一部分小鼠BMSCs体外扩增及ox-LDL对BMSCs凋亡的影响目的：体外分离培养小鼠BMSCs,探讨ox-LDL对其凋亡的影响。方法：采用密度梯度离心法+贴壁培养法分离扩增小鼠BMSCs,采用MTT方法测定MSCs的生长曲线,应用流式细胞仪测定细胞表面抗原表达,成脂诱导分化鉴定BMSCs分化能力。Annexin-V/PI及TUNEL检测ox-LDL对MSCs凋亡的影响。结果：刚分离的小鼠骨髓细胞呈圆形,经多次换液、传代后去除悬浮细胞,可见MSCs贴壁生长,第三代细胞行流式细胞术检测表面抗原,显示CD29阳性,而CD31、CD34、CD45阴性,成脂分化示MSCs能分化为脂肪细胞。Annexin-V/PI细胞凋亡检测示不同浓度ox-LDL(0、10、20、40μg/mL)干预24h后MSCs凋亡率分别为2.0±0.9%、3.2±1.2%、3.9±1.8%、4.3±2.2%,凋亡率差异无显著性(P>0.05);20μg/mL的ox-LDL干预0、6、12、24h后MSCs凋亡率分别为2.3±0.8%、3.4±1.2%、4.2±1.6%、3.9±1.4%,凋亡率差异无显著性(P>0.05)；TUNEL细胞凋亡检测示不同浓度ox-LDL(0.10、20、40μg/mL)干预24h后MSCs凋亡率分别为2.1±1.0%、2.9±1.2%、4.0±0.9%、3.7±1.3%,凋亡率差异无显著性(P>0.05)；20μg/mL的ox-LDL干预0、6、12、24h后MSCs凋亡率分别为2.5±0.7%、3.7±1.3%、4.2±1.2%、4.0±1.0%,凋亡率差异无显著性(P>0.05)。结论：本课题采用密度梯度离心法+贴壁培养法成功地分离和体外扩增出较为均一的BMSCs。短时间低至中浓度的ox-LDL对MSCs凋亡无明显影响。第二部分Let-7g/LOX-1介导MSCs吞噬ox-LDL目的：观察小鼠BMSCs对ox-LDL的吞噬及微小RNA let-7g和膜受体LOX-1在其中的作用。方法：采用ELISA方法检测MSCs是否能吞噬ox-LDL,实时定量PCR和/或检测western blot检测ox-LDL干预后let-7g和LOX-1表达水平的变化；分别采用LOX-1特异性拮抗剂LOX-1单抗以及let-7g类似物预处理细胞,检测MSCs对ox-LDL吞噬作用的改变程度。结果：20μg/mL ox-LDL干预MSCs24h后细胞内ox-LDL浓度显著升高,为无ox-LDL干预对照组的6.0±0.8倍,P<0.05。Ox-LDL干预能浓度依赖性促进膜受体LOX-1mRNA及蛋白水平表达,0、10、20、40μg/mL ox-LDL处理后LOX-1mRNA表达水平分别为1.0±0.2、2.2±0.15、3.3±0.3、3.5±0.2,ox-LDL干预组与对照组比较,差异有显著性,P<0.05;LOX-1蛋白表达水平分别为1.0±0.3、2.0±0.2、3.2±0.3、3.1±0.4,ox-LDL干预组与对照组比较,差异有显著性,P<0.05。Ox-LDL干预也呈时间依赖性促进膜受体LOX-1mRNA及蛋白水平表达,20μg/mL ox-LDL处理MSCs后0、6、12、24h LOX-1mRNA表达水平分别为1±0.15、1.9±0.2、2.7±0.2、3.3±0.3,ox-LDL干预组与对照组比较,差异有显著性,P<0.05;LOX-1蛋白表达水平分别为1.0±0.2、1.7±0.3、2.7±0.3、3.2±0.2,ox-LDL干预组与对照组比较,差异有显著性,P<0.05。50nM Let-7g类似物能显著抑制20μg/mL ox-LDL诱导的LOX-1mRNA及蛋白表达升高,分别为1.8±0.15vs3.3±0.15,P<0.05和2.0±0.25vs3.2±0.2, P<0.05。20μg/mL ox-LDL干预24h能显著抑制微小RNAlet-7g表达,为0.4±0.06vs0.0±0.08, P<0.05;10μg/mL LOX-1单抗能显著提高ox-LDL抑制的let-7g表达,为0.8±0.04vs0.4±0.06,P<0.05。LOX-1单抗或let-7g类似物均能显著对抗MSCs对ox-LDL的吞噬作用,分别为2.0±0.2vs6.0±0.8,P<0.05及1.7±0.3vs6.0±0.8,P<0.05。结论：小鼠BMSCs能吞噬ox-LDL,这种吞噬作用与微小RNA Let-7g和膜受体LOX-1相关。第三部分Let-7g/LOX-1-Akt2途径介导ox-LDL对MSCs增殖和迁移能力的影响目的：观察ox-LDL对小鼠BMSCs增殖和迁移能力的影响,以及这种影响是否由let-7g/LOX-1-Akt2途径介导方法：采用MTT的方法检测ox-LDL干预前后MSCs的增殖能力,使用Transwell实验检测ox-LDL干预前后MSCs的迁移能力,同时采用实时定量PCR和western blot检测let-7g/LOX-1-Akt2通路相关基因mRNA和蛋白水平表达；分别采用LOX-1特异性拮抗剂LOX-1单抗以及let-7g类似物预处理细胞,检测ox-LDL诱导的MSCs增殖和迁移能力变化及相关基因表达改变。结果：20μg/mL ox-LDL干预MSCs24h后细胞增殖能力明显增强,细胞数为对照组的1.6±0.18倍(P<0.05)。LOX-1单抗或let-7g类似物能抑制ox-LDL诱导的细胞增殖能力变化。20μg/mL ox-LDL干预MSCs24h后细胞迁移能力明显增强,LOX-1单抗或let-7g类似物能抑制ox-LDL诱导的细胞迁移能力增强。Ox-LDL干预能浓度和时间依赖性促进Akt2、MMP-2mRNA水平表达。10μg/mL LOX-1单抗或50nM Let-7g类似物能显著抑制20μg/mL ox-LDL干预24小时诱导的Akt2、MMP-2mRNA表达升高。20μg/mL ox-LDL干预24小时亦诱导Akt2、MMP-2蛋白水平表达升高。10μg/mL LOX-1单抗或50nM Let-7g类似物能显著抑制20μg/mL ox-LDL干预24小时诱导的Akt2、MMP-2蛋白表达升高。Ox-LDL干预能浓度依赖性抑制Akt1、 eNOS mRNA水平表达。Ox-LDL干预也呈时间依赖性抑制Akt1、eNOS mRNA水平表达。10μg/mLLOX-1单抗或50nM Let-7g类似物能显著提高20μg/mL ox-LDL干预24小时后抑制的Akt1、eNOS mRNA表达。20μg/mL ox-LDL干预24小时亦抑制Akt1、eNOS蛋白水平表达。10μg/mL LOX-1单抗或50nM Let-7g类似物能显著提高20μg/mL ox-LDL干预24小时抑制的Akt1、eNOS蛋白表达。结论：Ox-LDL能诱导小鼠BMSCs增殖和迁移,这一促进迁移作用由Let-7g/LOX-1-Akt2途径介导,伴随MMP-2表达水平升高及Akt1、eNOS表达的抑制。