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肺癌是最常见的恶性肿瘤，在所有癌症中死亡率居于首位。每年超过100万人死于肺癌。肺癌可以分为非小细胞肺癌（NSCLC）和小细胞肺癌（SCLC）两种组织类型，NSCLC占肺癌患者的75%-85%。MicroRNA是一种非编码、小片段（约20-22基核苷酸长度）、单链的RNA分子。作为一种新的基因调节因子，MicroRNA可以抑制基因的表达。据估计，在哺乳动物体内microRNA参与调控超过60%的蛋白编码基因的活性。MicroRNA参与调节了包括细胞生长、发育、凋亡等在内的几乎所有已知的细胞生理过程，并且microRNA表达的改变与人体的生理机能紊乱，尤其是肿瘤过程密切相关。一些MicroRNA通过不同的信号通路抑制肿瘤的生长。近期科学家化学合成双链RNA模拟物（RNAsmimics）作为内源基因转染入细胞。本研究假定microRNA let-7a和miR-34amimics均作为肿瘤的抑制基因。MicroRNA let-7在从蠕虫到人等不同物种间均具有高度的保守性，其所在的染色体区域在肿瘤细胞中通常会被删除。在人类与小鼠体内分别有13和14种不同的microRNA let-7家族成员，在人体，其家族成员分别为Let-7a、a-2、a-3、7b、7c、7d、7e、f7-1、f7-2、7g、7i、mir-98、andmir-202。但不同动物的microRNA let-7之间存在相同的序列。MicroRNA-34家族由miR-34a、miR-34b和miR-34c三者构成， miR-34a由其独有的基因转录而成。外源miR-34a和miR-34b/c可以在G1期引起细胞周期抑制。MiR-34a位于染色体1p36.23区，通常情况下其在多种疾病如B-淋巴样恶性肿瘤、结肠癌以及许多其它类型的疾病中出现表达异常。在许多肿瘤细胞系中，外源性miR-34a过表达可以引起凋亡途径的重新活化，证明miR-34a是一种有效的肿瘤抑制基因。并通过RT-qPCR方法确定了肺癌细胞中表达最为稳定的内参基因。目的:尽管对于microRNA与细胞凋亡、细胞周期之间相关性的研究仍处于起步阶段，然而对于这一领域的探索可以是我们更深入的了解控制凋亡以及细胞周期的分子通路，从而为未来的治疗提供依据。在本研究中，我们着重研究了：在肺癌细胞体外研究中，探讨了MicroRNA let-7a和microRNA34a的抗肿瘤作用及其在凋亡、细胞周期、细胞生长过程中的作用机制。方法:(1)由GenePharma公司设计并合成microRNA let-7a和microRNA34amimic。(2)本研究选用A549和NCI-H446两株肺癌细胞，每个细胞系分为4组，分别为let-7a组、miR-34a组、阴性对照组以及未转染组。(3)转然后48至72小时收集细胞用于后续实验。(4) MTT法检测四个组的细胞增殖状态。(5)提取总RNA并进行逆转录合成cDNA。(6) RT-qPCR用于检测内源性miRNA let-7a，miR-34a以及阴性对照的表达，证明其转染成功。(7)采用RT-qPCR法检测每组细胞的k-ras、CCDK4、bcl-2、c-myc、Bax、P53以及p57基因，通过Ct值比较法分析其mRNA相对表达量。(8)采用流式细胞术分析细胞的凋亡和细胞周期。(10)利用Western blot分析C-MYC, BCL2and P53蛋白表达水平。(9)为了确定在应用RT-qPCR研究肺癌基因表达过程中表现最为可靠的内参基因，我们用RT-qPCR检测了18S、GAPDH、RPLP0、ACTB、PPIA、PGK1、B2M、RPL13A、HPRT1以及TBP等10种mRNA内参基因在不同处理状态下的肺癌细胞系A549、NCI-H446中的表达情况。(10)应用BestKeeper、NormFinder和geNorm软件确定最稳定的内参基因。结果：1.外源microRNA let-7a和miR-34a成功转染肺癌细胞系A549和NCI-H446。2.外源性microRNA let-7a和miR-34a转染肺癌细胞系A549和NCI-H44648小时后，细胞增殖受到抑制。3. microRNA let-7a和miR-34a模拟物转染肺癌细胞系A549和NCI-H44648小时后，均诱导了细胞凋亡。microRNA let-7a转染组、阴性对照组及非转染组A549细胞凋亡结果分别为10.93±0.64291、1.4±0.4和1.53±1.02；miR-34a转染组、阴性对照组和非转染组A549细胞凋亡结果分别为13.93±1.40，2.27±0.75和2.03±0.40；然而microRNA let-7a转染组、阴性对照组及非转染组NCI-H446细胞凋亡结果分别为9.4±1.41、1.4±0.3和2.57±0.37；miR-34a转染组、阴性对照组和非转染组NCI-H446细胞凋亡结果分别为12.3±1.7、2.1±0.62、1.97±0.37。4.细胞周期分析结果显示，microRNA let-7a和miR-34a转染A549和NCI-H446细胞48小时后细胞停滞于G0/G1期。microRNA let-7a转染组、阴性对照组和非转染组A549细胞G0/G1期百分比分别为75.42±1.34、64.94±1.54和63.74±1.83；miR-34a转染组、阴性对照组和非转染组A549细胞G0/G1期百分比分别为76.85±.27、64.94±1.54和63.74±1.83；microRNA let-7a转染组、阴性对照组和非转染组NCI-H446细胞G0/G1期百分比分别为70.98±.72、59.57±0.8和60.51±0.78；miR-34a转染组、阴性对照组和非转染组NCI-H446细胞G0/G1期百分比分别为73.34±1.07、60.57±1.157和60.11±1.78。5.转染microRNA let-7a和miR-34a的A549细胞和NCI-H446细胞中，与阴性对照组和非转染组相比bcl-2，C-myc和k-ras的mRNA表达显著降低，p53、CCDK4及Bax的mRNA表达显著增加（P<0.05）。6. Western blot分析结果显示，与阴性对照组和非转染组相比，microRNA let-7a和miR-34a转染的A549和NCI-H446细胞中bcl-2及C-myc表达水平显著降低（p<0.05）；而P53仅在转染miR-34a组表达上调（p<0.05）。7.利用实时荧光定量PCR法确定肺癌体外实验中表达最为稳定的内参基因的实验数据表明，利用BestKeeper软件所分析的10种内参基因中，GAPDH表达稳定性最高，其次为18S，PPIA和HPRT1表达最不稳定。此外，norm Finder分析PPIA表达稳定性最高，ACTB次之，B2M和RPLP0表达稳定性最低；geNorm分析ACTB、PGK1以及PPIA表达最为稳定，B2M和RPLP0表达稳定性最低。结论：本文重点研究经过microRNA let-7a和miR-34a转染对于肺癌细胞系A549和NCI-H446的肿瘤抑制作用及其分子机制，同时利用实时荧光定量PCR法确定肺癌体外实验中表达最为稳定的内参基因。1.我们分别在肺癌细胞系A549和中成功转NCI-H446染了microRNAlet-7a和miR-34a。2. MTT结果显示外源性microRNA let-7a和miR-34a转染在两株肺癌细胞系中均可以导致生长抑制。3.外源性microRNA let-7a和miR-34a模拟物转染可以导致肺癌细胞停滞在在G0/G1期，并且可以通过上调P-53基因和下调Bcl-2、C-myc基因引起细胞凋亡。4. microRNA let-7a和microRNA-34a mimics转染A549细胞和NCI-H446肺癌细胞系48小时后显著上调p53、 CCDK4、p57和bax mRNA水平的表达，并引起bcl-2、k-ras和c-myc mRNA水平的表达下调。5.蛋白水平上，microRNA let-7a和microRNA-34a mimics转染A549细胞和NCI-H446肺癌细胞系48小时后，bcl-2及C-myc显著下调；.P53仅在转染miR-34a组上调。6.基于BestKeeper、NormFinder和geNorm三个软件对于实时荧光定量PCR结果的分析，ACTB、PPIA和PGK1被确定为肺癌体外实验中表达最为稳定的内参基因。我们的工作证明，肿瘤抑制物microRNA let-7a以及尤其是miR-34a能够引起细胞周期抑制和细胞凋亡。进一步需要进行microRNA let-7a以及尤其是miR-34a的体内及体外抑制试验，如siRNA实验，以证实本研究结果。