论文部分内容阅读
目的和意义：研究发现细胞外基质金属蛋白酶诱导因子（Extracellularmatrixmetalloproteinaseinducer，Emmprin,CD147）在乳腺癌、肝癌、喉鳞癌、前列腺癌等多种恶性肿瘤中高度表达，而且与肿瘤的恶性程度相关，但与白血病浸润、转移关系目前并未有明确研究。本研究通过慢病毒干扰载体干扰人单核细胞白血病细胞株SHI-1细胞的CD147表达，建立SHI-1细胞与急性白血病骨髓基质细胞(bonemarrowstromalcells,BMSCs)体外共培养模型，观察干扰CD147表达后SHI-1细胞体外增殖、侵袭能力的影响，并通过裸鼠白血病模型，进一步明确CD147在白血病浸润、转移中的作用。方法：1、参照文献设计，针对CD147的RNAi靶点序列，合成靶序列OligoDNA，退火形成双链DNA，与经AgeⅠ和EcoRⅠ双酶切后的pGCSIL-GFP载体连接产生RNA慢病毒载体pGC-LV，PCR鉴定阳性克隆并测序，测序正确的pGC-LV/CD147、pHelper1.0和pHelper2.0质粒经脂质体2000，共转染293T细胞，获得重组慢病毒，用逐孔稀释法测定病毒滴度，同理针对CD147阴性干扰序列，构建阴性病毒，测定病毒滴度。2、病毒构建成功后，用PGC-LV/CD147慢病毒及阴性对照病毒感染SHI-1细胞，分别命名为SHI-1/CD147及SHI-1/NC细胞，实验分为SHI-1、SHI-1/CD147及SHI-1/NC三组，感染后用流式细胞仪检测(FCM)细胞中GFP荧光率。用RT-PCR检测各组细胞中CD147、MMP-2、MMP-9mRNA的表达。WesternBlot检测各组细胞中CD147蛋白的表达。成功干扰SHI-1细胞CD147表达后，MTT法检测各组细胞体外增殖能力。3、收集急性非淋巴细胞白血病患者骨髓，培养BMSCs，按1:10比例将BMSCs与SHI-1细胞混合接种于铺有Matrigel基质胶的Millicell小室中，共培养24h后，将下层液体混匀，用血球计数板计数跨Matrigel胶移行至小室下层的细胞总数，计算移行细胞比例。4、裸鼠动物实验：①皮下成瘤：购买6周龄BALB/c裸鼠，不进行任何处理。裸鼠给予左前肢皮下注射5X10~6/只SHI-1、SHI/NC、SHI-1/CD147三组细胞，每组6只，观察皮下肿瘤大小，测量肿瘤体积和肿瘤重量并对肿瘤进行HE染色及免疫组化检测皮下肿瘤CD147蛋白的表达。②经尾静脉接种：6周龄BALB/c裸鼠进行切牌（splenectony），环磷酰胺腹腔注射（cytoxan intraperitoneal injection）及全身亚致死剂量辐照（sublethal irradiation）等预处理（SCI预处理），经尾静脉接种1X10~7个SHI-1、SHI-1/NC、SHI-1/CD147细胞，每组8只，观察裸鼠生存期，在裸鼠濒死前或死亡后立即解剖，观察各脏器肿瘤生长情况，取肝、肺、肾等组织于10%的中性甲醛中固定，常规石蜡包埋切片，HE染色，采用抗人CD45抗体进行免疫组织化学染色反应，观察白血病细胞在脏器中浸润分布情况。结果：1、通过逐孔稀释法，成功构建了可供转染的且带有GFP绿色荧光的慢病毒，测得阳性病毒滴度为1×10~9TU/ml，阴性病毒滴度为2×10~9TU/ml。2、FCM检测SHI-1/CD147GFP荧光率为94%、SHI-1/NC为82%， WesternBlot检测发现SHI-1/CD147细胞的CD147蛋白较SHI-1/NC下将91%，SHI-1/NC与SHI-1细胞之间无统计学差异。RT-PCR检测发现SHI-1/CD147细胞CD147、MMP-2及MMP-9mRNA表达比SHI-1/NC细胞分别下降83%、72%及63%，而SHI-1/NC与SHI-1细胞之间无统计学差异。成功干扰SHI-1细胞CD147表达后，MTT发现SHI-1/CD147组细胞不同时间点的OD值显著低于SHI-1组及SHI-1/NC组细胞（均p＜0.05)。3、单独SHI-1细胞不能跨Matrigel基质胶向Millicell下层移行，与BMSCs共培养后，SHI-1细胞及SHI-1/NC细胞跨Matrigel基质胶向下层移行能力显著提高，24h后移行至下层的细胞占接种细胞数的比例分别为SHI-1+BMSCs：18.2±2.5%（15%～21%）；SHI-1/NC+BMSCs：16.5±2.7%（13.5%～19.5%）；SHI-1细胞组和SHI-1/NC组无统计学差异（p＞0.05），而SHI-1/CD147+BMSCs：4.5±1.2%（3%～6%），侵袭比例明显下降，与SHI-1组和SHI-1/NC组比较均有统计学意义（p<0.01）。4、裸鼠动物实验：①皮下成瘤发现：SHI-1/CD147细胞在裸鼠皮下形成的肿瘤重量和体积显著低于SHI-1及SHI-1/NC细胞在裸鼠皮下形成的肿瘤（p＜0.05）。免疫组化显示SHI-1/CD147瘤体中CD147表达低于SHI-1及SHI-1/NC肿瘤。②经尾静脉接种：接种SHI-1的裸鼠中位生存期为32天（22-33天），接种SHI-1/NC细胞的裸鼠中位生存期为28天（26-30天），而接种SHI-1/CD147细胞的裸鼠生存期明显延长，中位生存期为41天（24-47天），SHI-1/CD147组裸鼠生存期与SHI-1组和SHI-1/NC组比较均有统计学意义（p<0.05），尸体解剖显示接种SHI-1、SHI-1/NC细胞的裸鼠肝脏、肾脏、肺、胃、睾丸可见肿瘤生长，而接种SHI-1/CD147细胞在裸鼠体内脏器浸润能力下降， HE染色、人CD45免疫组化染色在裸鼠的肝脏、肾脏、肺、胃、睾丸均发现SHI-1细胞浸润。结论：（1）我们成功构建的慢病载体，通过感染SHI-1细胞，可对其生物学行为做进一步研究。（2）SHI-1/CD147细胞的体外增殖及侵袭能力明显下降，且通过RT-PCR发现MMP-2、MMP-9mRNA表达下降，这可能与干扰CD147表达后，不能刺激SHI-1细胞分泌MMPs有关。（3）在白血病患者BMSCs与白血病SHI-1细胞接触时，SHI-1细胞跨Matrigel基质胶能力提高，干扰CD147表达后，其侵袭能力下降，可能是BMSCs与SHI-1细胞通过CD147来诱导SHI-1细胞提高跨Matrigel侵袭能力，这也可能是白血病细胞向髓外浸润的主要机制之一。（4）皮下成瘤结果表明，干扰CD147表达后，体外成瘤能力下降，免疫组化显示SHI-1/CD147肿瘤组织中CD147表达低于SHI-1及SHI-1/NC肿瘤。尾静脉结果表明，干扰CD147表达后，裸鼠生存期明显延长，且在脏器中的浸润、转移能力下降，进一步证实CD147可能诱导MMPs，促进肿瘤的浸润和转移。综上所述：本文通过构建慢病毒载体干扰CD147的表达，进行多器官浸润以及体外白血病SHI-1细胞和BMSCs共培养实验，发现干扰CD147的表达，可减少SHI-1细胞在裸鼠体内浸润、转移的的发生，CD147将成为白血病治疗的一个有效靶点。